Maestría en Ciencias Básicas Biomédicas
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Examinando Maestría en Ciencias Básicas Biomédicas por Autor "Castellanos Parra, Jaime Eduardo"
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Ítem Comparación del contenido proteico del esmalte de dientes permanentes sanos y con fluorosis(2014) Castiblanco Rubio, Gina Alejandra; Mejía Naranjo, Wilson Alfonso; Castellanos Parra, Jaime Eduardo; Martignon, StefaniaEl esmalte con fluorosis es menos mineralizado y más poroso que el esmalte sano y durante el desarrollo retiene mayor contenido proteico. La evidencia en esmalte fluorótico erupcionado es contradictoria y no se conoce (en comparación al esmalte sano) si tiene mayor abundancia de péptidos, sus características, ni las proteínas de las que provienen. Identificar y comparar el material proteico del esmalte dental erupcionado sano y con fluorosis moderada usando Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas en Tándem (LC-MS/MS). Se estandarizó el protocolo de extracción de proteínas con TCA. Se obtuvo el extracto proteico del esmalte de 8 molares sanos (n=4) y con fluorosis dental moderada (n=4). Sin digestión previa con tripsina, se analizaron con LC-MS/MS y se utilizó la base de datos de SwissProt usando Mascot 2.3. Se consideraron identificaciones con puntaje ≥24 y se elaboró un listado con los péptidos de AMELX comunes a todas las muestras (puntaje ≥10), se determinó su abundancia relativa y se comparó entre los grupos (sano/fluorosis) con la prueba t-Student. Los sitios naturales de corte se compararon con los reportados en la literatura. Se predijo la estructura terciaria de la amelogenina con el servidor I-Tasser y la cuaternaria con Z-DOCK. Las imágenes se editaron en Pymol. Se identificaron tres proteínas específicas del esmalte: AMELX/Y, AMBN y ENAM, estas dos últimas se reportan por primera vez en esmalte erupcionado. Mientras que AMEL se identificó en todas las muestras, ENAM se encontró solo en el 50% de los dientes fluoróticos. Se obtuvieron las secuencias de 19 péptidos de AMELX comunes a los dos tipos de esmalte que mostraron sitios de clivaje previamente reportados para MMP-20 y KLK-4; tienen de 8 a 18 residuos, masas moleculares menores a 2 kDa, provienen en su mayoría de la región N-terminal y se ubican internamente en nuestra predicción de la estructura terciaria y cuaternaria de AMELX. No encontramos diferencias significativas en la abundancia relativa de los péptidos de los dos tipos de esmalte. Con estos resultados sugerimos un posible papel de ENAM en la patogénesis de la fluorosis dental y soportamos la hipótesis de que en la fluorosis se presenta retraso en el corte de amelogenina y no retención permanente de sus péptidos en el esmalte erupcionado.Ítem Estudio de la participación del sistema ubiquitina-proteasoma durante el ciclo replicativo del virus chikungunya(2021) López Ibarra, Lady Stephanie; Calvo Tapiero, Eliana Patricia; Castellanos Parra, Jaime EduardoEl virus chikungunya (CHIKV) es un arbovirus de la familia de los alfavirus causante enfermedad febril acompañada de síntomas como rash cutáneo, poliartralgia, y mialgia.A pesar que el virus fue aislado por primera vez en la década de los 60, los periodos inter-epidémicos de más de 10 años y su contención en el continente Africano y Asiático por varias décadas contribuyó a que la investigación en este virus hasta antes de 2005, haya sido escasa y a que hoy en día se desconozcan numerosos aspectos de su ciclo replicativo y de la patogenia causada por él. Desde el año 2000 se considera una enfermedad reemergente, que ha infectado a millones de personas alrededor del mundo convirtiéndolo en un problema de salud pública. A pesar de la recurrencia de este virus, actualmente no existen medicamentos aprobados para su tratamiento o vacunas que permitan de alguna forma disminuir los brotes. Una estrategia para encontrar nuevos antivirales es mediante la identificación de factores celulares que sean indispensables durante el ciclo de replicación viral. En este estudio se analizó la relevancia del sistema ubiquitina-proteasoma durante el ciclo de replicación de CHIKV. En esta investigación se encontró que durante la inhibición del proteasoma y de enzimas deubiquitinadoras, se redujo drásticamente la producción de nuevas partículas virales y el porcentaje de infección disminuyó, en una fase temprana de la infección, es decir en un evento post-entrada del ciclo de replicación viral. Además, el tratamiento con los inhibidores permitió establecer los eventos de la replicación viral que más se veían afectados, es decir, la síntesis de ARN viral y la traducción de proteínas virales. Por otra parte, se evidenció un cambio significativo en los perfiles de ubiquitinación durante la infección por CHIKV. Adicionalmente, mediante estudios de proteómica se identificó un aumento significativo en el número de proteínas ubiquitinadas en células infectadas, se estableció que estas proteínas están involucradas en distintas vías de señalización o del metabolismo celular, lo cual sugiere una modulación de estas proteínas durante la infección por CHIKV. Finalmente, se determinó que las proteínas estructurales y no estructurales de CHIKV son blancos de ubiquitinación. Nuestros resultados demostraron como el virus chikungunya requiere de los distintos componentes del sistema ubiquitina-proteasoma para establecer una infección productiva. Este hallazgo tiene una fuerte implicación pues se encontró un factor celular clave asociado en el ciclo de replicación viral, y como éste puede ser postulado para el desarrollo de nuevas estrategias antivirales.Ítem Evaluación de la excitotoxicidad por glutamato inducida por el virus dengue neuroadaptado D4MB-6(2015) Camacho Ortega, Sigrid Johanna; Velandia Romero, Myriam Lucia; Castellanos Parra, Jaime EduardoEl virus de dengue (DENV), a pesar de ser clasificado como un virus no neurotrópico, induce durante la infección manifestaciones neurológicas como la alteración de la conciencia. Hasta el momento, los signos y síntomas neurológicos que aparecen durante la infección por DENV no se han asociado a un mecanismo en particular. Durante la infección con el JEV, WNV y el HIV se produce la disfunción y muerte de neuronas mediada por procesos excitatorios. Para Dengue, hasta el momento sólo se ha reportado en modelos in vivo e in vitro y en muestras post-mortem el daño del tejido y la perdida neuronal, sin embargo no se conoce si durante la infección con este virus suceden eventos excitotoxicos o si la la exacerbada respuesta inmune afecta la superviviencia neuronal En el presente estudio se planteó -utilizando el modelo de neuroinfección desarollado en nuestro laboratorio-, evaluar las posibles causas de alteración y muerte neuronal inducidas por la cepa D4MB-6 y el efecto de dos fármacos, ácido valproico (VPA) y MK-801 con el fin de. Para esto, se infectaron ratones Balb/C de 7 dpn con el D4MB-6 tratados o no tratados con VPA o MK 801. Los animales fueron observados y pesados diariamente por 3 o 6 dpi y sacrificados para la extracción del encéfalo y médula. De estos tejidos se obtuvieron homogenizados o cortes histológicos para evaluar la infección y producción viral, la morfología, la expresión de algunas proteínas pro y anti-apoptóticos. En los animales infectados no tratados, las manifestaciones clínicas fueron evidentes al 3er dpi y severas al 6to dpi, al igual que las alteraciones histológicas, caracterizadas por apoptosis, necrosis y espongiosis neuronal acompañadas de alteraciones vasculares como hemorragias, edema e infiltrado de células mononucleares. En esta misma, condición se observó astrogliosis, neurodegeneración y aumento en la expresión de proteínas pro-apoptóticas, como Casp 3, 8, y Bax. Por el contrario, en los animales infectados y tratados todas las manifestaciones y alteraciones neurológicas fueron reducidas, detectando sólo algunas células en apoptosis y neurodegeneración en el cerebelo de animales infectados y tratados con VPA y MK 801, al igual que la producción y transcritos pro- apoptóticos. Estos resultados sugieren que el virus D4MB-6 induce encefalitis y mielitis, como alteración vascular, así como muerte neuronal mediada por procesos excitotóxicos e inmunológicos. Dichas alteraciones son prevenidas de forma total o parcial con los fármacos MK 801 y VPA.Ítem Evaluación del desempeño de diferentes pruebas serológicas y virologicas para la confirmación de casos de infección por CHIKV en niños con síndrome febril(2021) Jaimes Jaimes, Nayeli Alejandra; Castellanos Parra, Jaime Eduardo; Jaimes Jaimes, Nayeli Alejandra [0000-0001-8274-8562]Introducción: El diagnóstico de laboratorio es importante para la confirmación de los casos probables de infección por virus de chikungunya (CHIKV) y se recomienda usar pruebas moleculares basadas en la detección del genoma viral por PCR previa transcripción inversa, en muestras recolectadas durante la fase febril. Objetivo: Evaluar el desempeño de diferentes métodos de detección de RNA viral de CHIKV en muestras de individuos con sospecha de arbovirosis. Metodología: Se realizó extracción de RNA a muestras de suero de individuos febriles, y se procesaron por el método descrito por Calvo et al, en 2016 como estándar de diagnóstico. Simultáneamente se procesaron por una PCR anidada y dos qPCR utilizando los cebadores reportados por Pastorino en 2005 y Lanciotti en 2007. Los datos obtenidos se analizaron en Stata, evaluando la frecuencia de muestras positivas y comparando las variables operativas de cada una de las pruebas. Determinando la sensibilidad y especificidad de cada una de las pruebas. Resultados: Del total de las 196 muestras analizadas, el 83,16% fueron positivas para la RT-qPCR dirigida contra el gen E1, el 79,59% positivas para la qPCR dirigida contra el gen nsP4, el 73,47% y 75% resultaron positivas en las PCR anidada dirigida contra el gen E1 y NSP4 respectivamente. La sensibilidad y especificidad de la qPCR de Pastorino fue de 90.0% (IC 84.2%-93.8%) y 39.1% (IC 26.4%-53.5%), mientras que los valores de sensibilidad obtenidos en la PCR anidada fueron 95.7% (IC 91.2%-98%) y 83.3% (IC 76.6%-88.4%), mientras que la especificidad fue de 98.9% (IC 90.6%-99.9%) y 54,3% (IC 40.2%-67.8%) respectivamente. Conclusión: Los resultados indican que la qPCR realizada con los cebadores de Pastorino presenta una sensibilidad superior respecto a las dos PCR anidadas, lo cual sugiere que esta prueba permitiría identificar un mayor número de casos.Ítem Evaluación del papel inmunoregulador de sST2 en células mononucleares de sangre periférica durante la infección ex vivo con virus denguePérez Acosta, Adriana Marisol; Castellanos Parra, Jaime Eduardo; Delgado Tiria, Felix GiovanniEl dengue grave se caracteriza por altos niveles de citocinas como TNFα e IL-6, que pueden inducir aumento en la permeabilidad vascular, debido específicamente a un efecto pro-inflamatorio/vasodilatador sobre las células del endotelio vascular. Recientemente, se ha reportado que pacientes con dengue presentan niveles elevados de la isoforma soluble de ST2 (sST2) en el suero, sugiriendo que esta proteína podría jugar un papel importante durante la inmunopatogénesis de la enfermedad. Por otro lado, se ha reportado que sST2, un miembro de la familia de receptores de IL-1, inhibe la producción de citocinas proinflamatorias en macrófagos estimulados con lipopolisacárido (LPS). El presente trabajo tuvo como propósito establecer un modelo de infección in vitro, empleando células mononucleares de sangre periférica (CMSP) no fraccionadas infectadas con virus dengue serotipo 2 (DENV-2), que permitiera identificar la célula diana permisiva a la infección con el virus y aquellas células responsables de la producción de TNFα e IL-6, para así evaluar efecto de la proteína recombinante sST2-Fc sobre la producción de estas citocinas proinflamatorias. Como resultado, se encontró que las CMSP fueron permisivas a la infección y los monocitos CD14+, pero no linfocitos CD3+ o CD19+, fue la subpoblación celular preferencialmente infectada y responsable de la producción de TNFα e IL-6. Adicionalmente, las CMSP infectadas no produjeron sST2. Finalmente, la proteína recombinante sST2-Fc ejerció su efecto imunoregulador a una concentracion 10µg/mL sobre monocitos estimulados con LPS por 12 horas, pero este efecto no fue observado cuando los monocitos fueron infectados con DENV-2. Estos resultados podrían sugerir que la proteína sST2 no juega un papel en la regulación de la respuesta inmune durante la infección con DENV y que por el contrario, podría participar en el desarrollo del dengue grave.Ítem Identificación de las vías de propagación utilizadas por un virus dengue neuroadaptado para ingresar al sistema nervioso(2013) Bastidas Legarda, Leidy Yamile; Velandia Romero, Myriam Lucia; Castellanos Parra, Jaime EduardoEl Virus del Dengue (DENV), aunque es considerado un virus no neurotrópico, en algunas ocasiones logra ingresar, invadir y alterar el Sistema Nervioso (SN), induciendo manifestaciones neurológicas como dolor de cabeza severo, desórdenes en el comportamiento, convulsiones y parálisis, entre otras. Esto sugiere que el perfil clínico de la enfermedad del dengue está cambiando y que el virus en algunos casos presenta un carácter neurotrópico, neuroinvasivo y neurovirulento, sin embargo, hasta el momento se desconocen los mecanismos asociados a la neuropatogenia por DENV. Recientemente nuestro grupo desarrolló un modelo de neuroinfección en ratones Balb/c utilizando una cepa de DENV-4 neuroadaptada, denominada D4MB-6 que inoculada por la vía intraperitoneal (i.p), infecta el sistema nervioso e induce signos de enfermedad similares a los observados en humanos, sin embargo, los mecanismos que podría utilizar este virus para ingresar e invadir el SN aún no son claros. Los virus naturalmente nerurotrópicos pueden diseminarse por la vía hematógena y llegar a los capilares cerebrales e ingresar al parénquima cerebral atravesando la Barrera Hemato-Encefálica (BHE), como virus libre, asociado a células inflamatorias o infectando células endoteliales de la microvasculatura cerebral. Estos virus también pueden ser capturados por terminaciones nerviosas y viajar por transporte axonal retrógrado hasta el soma neuronal en los Ganglios de Raíz Dorsal (GRD) ó médula espinal y diseminarse dentro del tejido nervioso.Ítem Molecular and biological characterization of an Asian-American isolate of chikungunya virus(2021) Archila Hernández, Edwin Darío; Castellanos Parra, Jaime Eduardo; Calvo Tapiero, Eliana Patricia; Archila Hernández, Edwin Darío [0000-0002-8633-8031]Background: Chikungunya virus is an arthropod-transmitted virus that causes chikungunya fever, a disease characterized by severe muscle and joint pain. The virus was introduced to the Americas in 2013 and caused approximately 2.7 million cases during the subsequent two years. The lack of knowledge regarding the biological behavior of the viral strains circulating during the outbreak has motivated the characterization of a virus isolated in Colombia in 2015. Methods: The full genomes of isolated and cultured viruses were obtained using next-generation sequencing. The infective and replicative capacities and their impact on viability were evaluated in three different cell lines, HEK293T, Huh-7, and MRC-5, to describe the biological behavior. The infection percentages were determined by flow cytometry, and cytopathic effects were evaluated by conducting a resazurin fluorescent metabolic assay. The viral yield of each cell line was quantified by conducting a virus plaque formation assay. The virus proteins and RNA kinetics were then evaluated by western blotting and Reverse transcription -qPCR. Results: The COL7624 isolate was clustered with other American and Caribbean sequences in the Asian American lineage. The T669A substitution in E2 distinguished it from other Colombian sequences reported in 2014. After 48 hpi, the three cell lines analyzed reached infection percentages exceeding 65%, generating a high load of infectious viral progeny. The infection kinetics indicated that the replication peak occurred around 24 hpi, although gRNA could be detected in the supernatant from 4 hpi onwards. Infection caused the overexpression of interferon and proinflammatory cytokines, such as IL-1, TNF-α, and IL-8. Conclusions: The COL7624 isolate exhibited a high infective and replicative capacity and induced the activation of the cellular immune response, similar to isolates belonging to the other genotypes.