Doctorado en Ciencias Biomédicas
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Ítem Evaluación de la actividad inmunomoduladora in vitro de un aislado clínico de Citomegalovirus humano(2023) Bohórquez Ávila, Sonia del Pilar; Castellanos Parra, Jaime Eduardo; Velandia Romero, Myriam Lucía; Bohórquez Ávila, Sonia del Pilar [0000-0002-2113-3959]El Citomegalovirus humano (HCMV) continúa siendo uno de los principales causantes de complicaciones en los pacientes trasplantados. A pesar de que existen varios reportes sobre la relación entre determinado(s) genotipo(s), el curso clínico e incluso el deceso del paciente, la identificación del genotipo de HCMV no se hace rutinariamente después de detectar la infección o la reactivación. Adicionalmente se sabe que este virus ejerce una compleja actividad inmunomoduladora, la cual al parecer le permite persistir en latencia en individuos inmunocompetentes, pero que en inmunosuprimidos puede facilitar la reactivación de la infección y la diseminación a diferentes compartimientos anatómicos y tejidos, hecho que puede estar relacionado con la gran variedad de complicaciones asociadas. El estudio in vitro de la actividad inmunomoduladora de HCMV se hace empleando cepas de referencia, con alto número de pasajes en cultivo celular, sin tomar en consideración las alteraciones genómicas producto de la adaptación, que pueden afectar el tropismo, la modulación inmunológica y la latencia, entre otros. Estas cepas se usan por la dificultad de obtener aislados clínicos de HCMV debido al ciclo replicativo lento y la probabilidad de coinfecciones. Es por esto por lo que se planteó evaluar y comparar la actividad inmunomoduladora in vitro de un aislado clínico de HCMV con cepas de referencia, en una línea celular de monocitos humanos. Para ello se plantearon tres estrategias metodológicas. En la primera se evalúo la posible relación entre los genotipos de HCMV con las complicaciones y el desenlace, en pacientes pediátricos receptores de trasplante de precursores hematopoyéticos (RTPH). En segundo lugar, se establecieron las condiciones metodológicas para aislar y cosechar HCMV a partir de muestras clínicas; finalmente, se evaluó y comparó in vitro la activación y expresión de mediadores inflamatorios en una línea celular de monocitos/macrófagos infectados con el aislado clínico, teniendo como referencia el efecto que inducen dos cepas de laboratorio del HCMV. A continuación, se describe la metodología y los resultados obtenidos de cada uno de los objetivos planteados. HCMV se transmite por contacto próximo a través de fluidos corporales como la orina, leche materna y saliva, por lo que la mayoría de los individuos infectados han adquirido el virus en los primeros años de vida y aparece en estos fluidos en las descargas virales asintomáticas. Por otra parte, se han identificado cinco genotipos de HCMV lo que demuestra su variabilidad genética y algunos estudios sugieren una relación entre el genotipo infectante, las coinfecciones (más de un genotipo) y el desenlace, sobre todo en RTPH. Sin embargo, hasta el momento en el país la genotipificación no es un procedimiento rutinario y no se considera a la saliva como una muestra confiable, útil para su rastreo. Para evaluar esto, se obtuvieron 105 muestras de saliva de 20 pacientes pediátricos RTPH recolectadas semanalmente en la Unidad de Trasplante de Precursores Hematopoyéticos de la Fundación Hospital Pediátrico la Misericordia (UT-HOMI). Se confirmó la infección de HCMV por PCR detectando el gen UL83; y por PCR anidada y secuenciación se determinó el genotipo. Se detectó el ADN viral en 29 muestras de 12 pacientes y en todos los casos se confirmó el genotipo gB1, sin coinfecciones. Luego del análisis no se estableció ninguna relación entre la detección de HCMV en saliva, el genotipo identificado, con las complicaciones y el desenlace en el grupo de pacientes que participó en el estudio. Este resultado confirma la alta frecuencia de HCMV en los pacientes, la factibilidad de emplear la saliva para la detección y genotipificación de HCMV y la necesidad de evaluar la relación entre el genotipo(s) identificado(s) con el curso clínico del paciente trasplantado. De otro lado, la obtención de aislados clínicos a partir de fluidos corporales puede resultar difícil, por el tiempo que puede demorar la aparición de efecto citopático (ECP) y porque en los primeros pasajes las partículas virales permanecen asociadas a las células y la concentración es baja en el sobrenadante celular. En nuestro segundo objetivo se propuso aislar el HCMV a partir de muestras de orina, lavado broncoalveolar (LBA) y plasma de pacientes hospitalizados en el HOMI. De 61 niños evaluados, se obtuvieron 6 muestras de orina, 27 de LBA y 37 plasmas. De las 9 muestras positivas por PCR para HCMV, se hicieron diluciones que se inocularon sobre células MRC-5 utilizando la técnica de centrifugación (Shell-vial), luego se retiró el inóculo y se observaron diariamente. De las 5 muestras con ECP se recolectó el sobrenadante, el cual fue inoculado nuevamente en células MRC-5. Sobre estas últimas -con ECP atribuible a HCMV- se recolectó y almacenó a -80°C el lisado celular sonicado y el sobrenadante. En las células inoculadas con plasma el cultivo mostró daño celular temprano que impidió continuar con el aislamiento. Solo a partir de una muestra de LBA -negativa para Virus Herpes Simplex 1 y 2, Adenovirus, Enterovirus y Poliomavirus-, se logró el aislamiento y amplificación de un HCMV genotipo gB1, que denominamos B52, con un título de 2.18 x106 UFP/mL, luego de su segundo pasaje. Estos resultados muestran que la obtención de aislados clínicos a partir de las descargas virales asintomáticas en fluidos como la saliva, LBA y la orina puede ser eficaz y eficiente implementando algunas estrategias técnicas como el Shell vial y lisando las células, lo que mejora los títulos y permite obtener un aislado con muy bajos pasajes en cultivo. Finalmente, luego de la infección primaria, HCMV establece latencia en las células CD34+ y persiste en los monocitos de sangre periférica CD14+. En estas células, el HCMV modula la respuesta inmunológica: i) promoviendo la activación de los monocitos circulantes y su diferenciación a macrófagos tisulares; ii) regulando la secreción de algunas citocinas y iii) reclutando células inmunes; así, genera un ambiente proinflamatorio, al tiempo que regula la respuesta inmune antiviral. Esta actividad es uno de los atributos de HCMV que lo hace altamente patogénico en individuos inmunosuprimidos, como los RTPH. Para el estudio de la actividad inmunomoduladora de HCMV comúnmente se utilizan cepas de laboratorio como Towne y Merlin, en las que por su alto o bajo número de pasajes -respectivamente- se han establecido modificaciones genómicas comprometiendo segmentos importantes que cambian el tropismo y la patogenicidad. Aun así, estas cepas son usadas con frecuencia debido a la dificultad de obtener aislados clínicos. Para evaluar el efecto del aislado clínico B52 en la activación y expresión de mediadores inflamatorios se utilizó la línea celular monocítica THP-1; las células fueron infectadas a una MOI de 1, con el aislado o con las cepas de referencia (Towne o Merlin), aplicando el modelo latencia – reactivación. Como control de diferenciación y activación celular las THP-1 fueron tratadas (+) o no tratadas (-) con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), y evaluadas a las 48, 72 y 120 horas posinfección (hpi). Al cabo de cada uno de los tiempos, se evaluó por citometría de flujo la expresión de marcadores de diferenciación CD14, CD64, CD11b, CD68 y activación celular CD206 y HLA-DR. Por RT-qPCR la expresión relativa de los transcritos para las citocinas asociadas a la activación, diferenciación y movilización de monocitos/macrófagos como IFN e IFNβ; TNF, IL-1β, CXCL-10, IL-8 e IL-10. Finalmente, en el sobrenadante se cuantificó la concentración de algunos de estos y otros mediadores como IFNγ, IL-6, CCL-18, IL-12p70, CXCL-9, IL-4, RANTES, MCP-1, CCL-22, MIP-1β, FAS-L y los factores de crecimiento VEGF-A, PDGF-AB. La expresión de marcadores de superficie de las células infectadas y tratadas con PMA mostró una expresión mayor de los marcadores CD14 y CD11b respecto al control. El efecto del aislado clínico B52 sobre la expresión de CD206 y HLA-DR fue dependiente de la estimulación con PMA y se incrementó con el tiempo. Las cepas de laboratorio Merlin y Towne indujeron una expresión más temprana de estos marcadores con disminución a las 120 hpi. La expresión relativa de los transcritos mostró que B52 moduló diferencialmente en el tiempo la expresión de los interferones y las citocinas proinflamatorias TNFα, CXCL-10, IL-1β e IL-8 y sobrereguló la expresión relativa de IL-10, respecto a las cepas Merlin y Towne. Sobre las concentraciones de citocinas y factores de crecimiento en el sobrenadante se encontró que el efecto de la infección con B52 estuvo por encima del inducido por las cepas de laboratorio en la mayoría de los casos, además de observarse en las primeras 48 horas luego de la infección. El efecto del tratamiento con PMA fue variable y no siempre significó incremento de las concentraciones de los analitos. Finalmente, en la secreción de IL-10 y de FAS-L, se observó un efecto diferencial y temprano con niveles más altos inducido por B52, principalmente en las células PMA (-), en comparación con el efecto de las cepas de laboratorio.Ítem Estrategia para la confirmación de casos de dengue, su clasificación y pronóstico: aportes de algunos marcadores serológicos y celulares(2023) Coronel Ruiz, Carolina; Velandia Romero, Myriam Lucía; Castellanos Parra, Jaime Eduardo; Coronel Ruiz, Carolina [0000-0003-2202-5682]Dengue es la arbovirosis humana de importancia en la salud pública en el mundo. La infección involucra la interacción de componentes del virus y factores del hospedero, los cuales se relacionan con un amplio espectro clínico que dificultan la identificación temprana de los casos. La infección induce variaciones en los niveles de algunas proteínas que pueden estar relacionados con el pronóstico y la severidad. Estos marcadores biológicos -o biomarcadores-, son moléculas liberadas por las células como citocinas, quimiocinas, anticuerpos, proteínas constitutivas de la membrana plasmática que pueden afectar la integridad de tejidos como el endotelio. En la patogénesis de dengue, se produce una respuesta caracterizada por la liberación de moléculas que tienen efecto en la activación de células, e inducen cambios en la arquitectura y función de diferentes tejidos. El endotelio representa el principal tejido afectado y cumple un papel esencial favoreciendo la adherencia, permeabilidad y activación de células inmunes. Su alteración ha sido estudiada en procesos inflamatorios sistémicos en los que se ha analizado el efecto de la proteína de alta movilidad del grupo 1 (HMGB1) en la activación y disfunción, y su relación con la severidad. El objetivo del estudio fue establecer una estrategia para la confirmación de casos de dengue y definir el aporte de algunos biomarcadores serológicos y celulares para su clasificación y pronóstico. Por lo tanto, el trabajo integró el estudio de tres componentes esenciales en la infección por DENV, en el primero se realizó el análisis de variables clínicas y de laboratorio para el diseño de un algoritmo diagnóstico en la confirmación de casos de dengue. El segundo integró la medición de marcadores biológicos en muestras de individuos febriles, para identificar su utilidad en el diagnóstico y el pronóstico; el tercer componente, se centró en la activación y disfunción del endotelio y la exploración del papel que desempeña la proteína HMGB1 liberada por PBMCs durante la infección por DENV. El primer componente del estudio analizó 505 muestras de individuos con síndrome febril agudo mediante la aplicación de pruebas de diagnóstico rápido (PDR) -IgM e IgG y NS1-, y pruebas de ELISA de captura -IgM, IgG y NS1-, y RT-PCR. Se identificó que la sensibilidad, especificidad, valores predictivos y área bajo la curva (AUC) de las PDR fue inferior respecto al estándar (ELISA IgM Positivo o PCR positivo) al igual que las pruebas de ELISA. El análisis basado en la combinación de dos pruebas, aumentó la sensibilidad y especificidad entre 35% hasta el 50%. La inclusión de variables clínicas y hematológicas en un análisis de regresión logística identificó su utilidad en el diagnóstico y la clasificación de los casos (DWoWS, DWS, SD) y febriles no dengue (OFI). Estas variables se consideraron en el diseño de árboles de decisión para determinar el porcentaje de confirmación de casos. El algoritmo que integró la combinación de PDR NS1 OR ELISA IgM con mialgias, dolor abdominal, plaquetas <140.000/mm3 detectó el 90.6% de los casos, mientras la combinación de PDR IgM OR PDR NS1 con variables clínicas y hematológicas, identificó el 81.6%. El primer algoritmo puede ser utilizado en instituciones de salud que cuentan con capacidad para su aplicación en el diagnóstico de rutina; mientras que el segundo, en instituciones de áreas endémicas por la combinación de pruebas accesibles y de bajo costo, que complementan la información clínica y permitiría realizar un diagnóstico y tratamiento oportuno. El segundo componente del trabajo se centró en evaluar algunos biomarcadores, en muestras de individuos con dengue, febriles no dengue, e individuos sin antecedente de infección por DENV. El análisis evaluó la asociación entre los niveles de estas moléculas y la severidad de la enfermedad. Los niveles de los biomarcadores analizados no presentaron elevación significativa al comparar los grupos de diagnóstico y la severidad. Se encontró una asociación moderada entre los niveles de HMGB1 y la edad, y los niveles de tropomiosina con el recuento de leucocitos y plaquetas en el grupo DWoWS. Nuestros hallazgos confirman la complejidad de la búsqueda de biomarcadores para establecer pronóstico, y resaltan la necesidad del estudio simultáneo de biomarcadores en diferentes fases de la enfermedad para identificar su dinámica y asociación con las manifestaciones clínicas. El tercer componente del trabajo evaluó la activación y disfunción del endotelio y el papel que podría desempeñar la proteína HMGB1. La estrategia aplicada incluyó la evaluación de un modelo de células endoteliales polarizadas, expuestas a sobrenadantes de PBMCs infectados por DENV2 (I – Mo), no infectados (NI – Mo) o la proteína HMGB1 recombinante. Para identificar si los cambios en el endotelio fueron producidos por HMGB1 u otros factores, se consideró la evaluación de tres condiciones de neutralización. La primera dirigida contra HMGB1, la segunda la inhibición de los receptores de esta proteína (TLR4 y la combinación RAGE-TLR4), y la tercera la neutralización de tres citocinas (TNF-α, IL-6 e IL-8). Se identificó que las EC expuestas a los sobrenadantes I - Mo liberan HMGB1 entre otras moléculas, indujeron cambios en el endotelio caracterizados por un perfil inflamatorio temprano, sin afectar la viabilidad celular. La inhibición directa e indirecta evidenció que disminución en la TEER, variación en la permeabilidad, aumento en la expresión de mRNA y la expresión y localización de proteínas, son debidos al efecto conjunto de HMGB1 con otras moléculas. Estos hallazgos demuestran que los estímulos I – Mo y rHMGB1 están relacionados con la activación temprana del endotelio, los cambios morfológicos, y la alteración de la continuidad de las células. Podemos concluir que la activación y el daño endotelial son producto de la actividad de HMGB1 como alarmina, lo cual evidencia una cinética diferente durante el curso de la infección. Este efecto conduce a que la búsqueda de biomarcadores se convierta en un panorama complejo de interpretación, que requiere de una exploración de estrategias para la determinación del momento específico en el que presentan las manifestaciones clínicas asociadas a severidad y variaciones en los biomarcadores, conduciendo a la correcta interpretación de estos parámetros, y conduzcan a que la aplicación de algoritmos de diagnóstico tengan un alto desempeño en la detección y confirmación de los casos, demostrando su eficacia en la aplicación en una población específica.Ítem Desgaste dental erosivo y su relación con factores de riesgo, estado de salud dental, composición de saliva y biopelícula(2022) Avila Adarme, Leidy Viviana; Martignon Biermann, Stefania; Castellanos Parra, Jaime Eduardo; Avila Adarme, Leidy Viviana [0000-0003-1545-4219]Este estudio caracterizó en adolescentes colombianos, el desgaste dental erosivo (ETW), su riesgo y la composición proteica en saliva y microbiológica de biopelícula. Bajo aval ético, examinadores calibrados (reproducibilidad inter-/intra-examinador: Kappa-ponderado≥0.70) valoraron, en escolarizados (12-15 años) de Usaquén-Bogotá, presencia/severidad de ETW (BEWE-Máximo: mayor código, 0-3; BEWE-Total: suma del mayor código/sextante, 0-18), y riesgo de ETW (cuestionario). En una segunda parte, en tres subgrupos de individuos Sanos (G-S: n=10), con ETW (G-ETW: n=13) o, Caries severa-CS (G-C: n=10), se analizaron muestras de: -película adquirida y saliva para conocer composición proteica (LC-MS/MS, Western-Blot-WB, ELISA), biopelícula (composición bacteriana, rRNA-16S-Ilumina-miSeq). Se validó encuesta en contenido y constructo (AFE: KMO=0.68; Cronbach’s α=0.67; AFC: RMSEA=0.017; PRATIO=0.76), resultando en un instrumento de 24 ítems. Se valoró ETW y riesgo (n=454; edad promedio: 13.5±1.1 años; niñas: 61.7%). Prevalencia de ETW: 71.6%, BEWE-Máximo 3: 58.1%, BEWE-Total≤8: 84.3%; asociación multivariada (p<0.05) con cepillado antes de comer (ORa=3.98), CS (ORa=2.53), sexo masculino (ORa=2.53) y ≥14 años (ORa=1.83). Análisis de proteómica mostraron abundancia relativa diferencial de proteínas (t-Student, p<0.05) en G-ETW vs. G-S: sobre-reguladas (Antilecuporteasa, Histatina y Proteina-inducida-por-prolactina) y sub-reguladas (Hemoglobina-Beta, Defensina-1). WB: Cistatina, MUC5B, Antilecuproteasa y Defensina-1 (menor detección) en película adquirida y saliva donde fue más fácil detectar estas proteínas; ELISA: detección de proteínas-ricas-en-prolina con menores concentraciones promedio en saliva de G-S vs. G-C (U-Mann-Whitney, p<0.05). Composición bacteriana: mayor riqueza asociada a G-S; mayor abundancia relativa de ocho especies periodontalmente relevantes en G-ETW vs. G-S y en G-C vs. G-S: mayor abundancia relativa de siete especies sacarolíticas; G-S: mayor abundancia relativa de bacterias de la microbiota residente en ambas comparaciones. Adolescentes bogotanos presentaron alta prevalencia de ETW con severidad leve, asociada con edad, sexo, caries y hábitos orales. Se lograron detectar diferencias estadísticamente significativas en la composición proteica/bacteriana en película adquirida, saliva y biopelícula dental de los individuos con ETW.Ítem El sistema LiaFSR y resistencia a los péptidos antimicrobianos en enterococo(Universidad El Bosque, 2018) Rincon Nuñez, Sandra Liliana; Arias, Cesar AugustoLa envoltura celular es la primera línea de defensa bacteriana contra amenazas del medio ambiente, además de brindar a la célula su forma también participa en contrarrestar la presión osmótica interna y provee una interface sensorial y molecular entre la bacteria y el medio ambiente mediando el transporte controlado de solutos y el flujo de información. Por lo tanto, vigilar la integridad de la envoltura celular es una función vital para la supervivencia bacteriana. En consecuencia, debido al papel que desempeña en la homeóstasis bacteriana, esta constituye un blanco crítico para la acción de varios antibióticos usados en la práctica clínica. La daptomicina (DAP) es un antibiótico lipopéptido cíclico, relacionado estructuralmente a los péptidos catiónicos humanos. En su mecanismo de acción son relevantes la interacción con el calcio y los fosfolípidos de la membrana. DAP interfiere con la organización de lípidos en la membrana afectando múltiples procesos celulares, además de causar la disociación de proteínas de membrana periféricas esenciales. El sistema LiaFSR es un sistema de tres componentes conservado en bacterias patógenas Gram positivas del genero Firmicutes (bacterias con bajo contenido en GC). Este sistema de tres componentes está constituido por las proteínas LiaS (funciona como sensor/ histidina quinasa), LiaR (regulador de respuesta) y una proteína accesoria, LiaF (que ha sido caracterizada como un regulador negativo o positivo del sistema LiaFSR en ciertas especies bacterianas). El sistema desempeña un papel importante en la homeóstasis y la respuesta al estrés de la envoltura celular bacteriana en bacterias Gram Positivas. Particularmente, dos grupos de genes se han asociado con el mecanismo molecular de resistencia a DAP en enterococos: cambios genéticos en i) genes que codifican para el sistema regulatorio de tres componentes LiaFSR (descrito anteriormente) y ii) genes que codifican para enzimás involucradas en el metabolismo de fosfolípidos (p. ej., gdpD glicerolfosforildiester-fosfodiesterasa y cls cardiolipina sintetasa, entre otros). Sustituciones en LiaFSR parecen ser los primeros eventos vitales en la evolución de la resistencia a DAP en enterococos y posiblemente a adaptaciones de la membrana celular que tiene como consecuencia cambios en la arquitectura de fosfolipidos de la misma. El papel crítico de LiaR en la respuesta adaptativa de la membrana bacteriana de enterococos frente a DAP, se establecio al deleciónar el gen que codifica para el regulador de respuesta, lo que causó un revertimiento total de la susceptibilidad a DAP en enterococos, y aún más notable la observación del incremento en la susceptibilidad a péptidos catiónicos humanos y la restauración de la arquitectura normal de los microdominios de fosfolípidos aniónicos en la membrana de E. faecalis. Estudios biofísicos y cristalográficos han demostrado que la activación de LiaR por fosforilación o por mutaciones que imitan el estado fosforilado, promovió cambios conformacionales de la proteína que aumentaron su afinidad por los promotores blanco liaFSR y liaXYZ, causando una activación del sistema. La función de los genes liaXYZ es desconocida, pero algunos presentan homología con algunos componentes de un sistema involucrado en la respuesta adaptativa frente al estrés de la membrana celular en bacterias Gram negativas. De esta manera, LiaR, el regulador maestro que coordina los mecanismos que conducen a preservar la respuesta a estrés de la envoltura celular en enterococo constituye un blanco atractivo para el desarrollo de estrategias antimicrobianas que inhiban su funcionalidad y de esta manera afecten la viabilidad bacteriana y potencialmente fomenten la actividad del sistema inmune innato. Dedido a la importancia del sistema LiaFSR y sus genes efectores en los mecanismos de adaptación de la membrana celular en la resistencia a DAP y a péptidos antimicrobianos en enterococcos, esta investigación busco caracterizar el papel del sistema LiaFSR en resistencia a DAP in vivo y el efecto en la actividad del sistema inmune innato. Esta caracterización brindo los siguientes resultados que indicaron:i) LiaF es muy posiblemente un activador del sistema LiaFSR; ii) El grupo de genes liaXYZ son efectores importantes del sistema y la deleción de LiaR causó una importante represión en la transcripción de los mismos; iii) El nuevo modelo de C. elegans desarrollado en este trabajo es ideal para caracterizar el efecto in vivo de liaR en la presencia de DAP; iv) Los resultados obtenidos en C. elegans con DAP son reproducibles en un modelo de peritonitis de raton en E. faecalis y E. faecium; v) La deleción de liaR en enterococos afecta la habilidad de la bacteria para desarrollar resistencia a antiobiótico y vi) Alteraciones del sistema LiaFSR afectan la habilidad de los neutrófilos en destruir cepas de enterococos, incluyendo aquellas que presentan multiresistencia a antibióticos.Este trabajo sienta las bases para desarrollar el concepto de antibióticos que afectan la adaptacion membranal con el desarrollo de un modelo simple y escalable in vivo. Adicionalmente, pudimos comprobar que alteraciones de la homeóstasis de la membrana también mejora la actividad del sistema inmune innato en destruir patógenos, un concepto novedoso antimicrobiano.Ítem Perfil biomolecular de aislamientos SARM con resistencia heterogénea a vancomicina (hVISA) de circulación en Latinoamérica(2021) Castro Cardozo, Betsy Esperanza; Díaz, Lorena; Castro Cardozo, Betsy Esperanza [0000-0003-1179-5382]Vancomicina es la principal opción terapéutica para tratar infecciones severas por Staphylococcus aureus resistente a meticilina, por lo tanto, la emergencia de aislamientos con resistencia intermedia heterogénea a vancomicina (hVISA) pone en riesgo la efectividad de antibiótico ocasionando un aumento en las fallas terapéuticas y estancias hospitalarias. Este fenotipo no se identifica de forma rutinaria por medio de las metodologías estándar de susceptibilidad, en donde hacen parte de los aislamientos susceptibles a la vancomicina y por lo cual su identificación se realiza empleando metodologías dispendiosas no que no se realizan en laboratorios clínicos de diagnóstico. Adicionalmente, el mecanismo de resistencia hVISA involucra cambios genéticos y fisiológicos que afectan el metabolismo celular originando alteraciones principalmente en la envoltura celular. Desafortunadamente, a pesar de que la identificación y la caracterización de cepas hVISA han revelado varias alteraciones genéticas potencialmente asociadas al desarrollo del fenotipo, estas no han sido consistentes en todos los aislamientos con este fenotipo y, por tanto, no han permitido esclarecer el mecanismo molecular. Por otro lado, la epidemiologia de las infecciones por SARM es dinámica a nivel mundial; se ha caracterizado por la emergencia y evolución de clones que se establecen en países o regiones específicas. Por esta razón, este trabajo identificar el perfil biomolecular de los aislamientos SARM con fenotipo hVISA que causan infecciones en pacientes en Latinoamérica, por medio de la integración de características genómicas, transcriptómicas y metabolómicas. A partir de 538 aislamientos SARM, se identificaron 30(5.6%) aislamientos con el fenotipo hVISA por métodos basados en E-test, pertenecientes en su mayoría al clon Chileno/Cordobés ST5, sin embargo, de estos, solo 3(0.56%) fueron confirmados mediante perfil de análisis poblacional/área bajo la curva (PAP/AUC). El genoma de estos aislamientos se analizó empleando la búsqueda de cambios puntuales reportados en la literatura asociados al fenotipo, detección de cambios genéticos que discriminen entre hVISA y VSSA por medio de análisis GWAS (Genome-wide association studies) y discriminante lineal (LDA). De igual manera se caracterizó el transcriptoma y metaboloma de hVISA confirmados por PAP/AUC con el propósito de identificar los procesos fisiológicos alterados. A nivel genómico se identificaron tres cambios predominantes (90% de los hVISA) asociados a sistemas reguladores (VraT-E156G y WalK-L14I) y a la autolisina Atl-Y38H; mientras que por el análisis de GWAS y LDA se identificaron 11 cambios comunes asociados a virulencia (adhesina SdrC,D), transportadores de membrana, metabolismo de carbohidratos y aminoácidos. Algunos de estos hallazgos se correlacionaron con los hallazgos transcripcionales identificados como sobrexpresión en sdrD y lacE y específicamente en los hVISA-ST5 como sobreexpresión en la capsula y sistema de secreción Ess. Otro hallazgo muy interesante fue la sobrexpresión de cidA que está involucrado en al ciclo de ácido tricarboxilico en cual se encuentra alterado en los aislamientos hVISA que conlleva a una reducción de síntesis de aminoácidos (valina, leucina y treonina) y nucleósidos. Estos resultados ponen en evidencia la detección y caracterización del fenotipo hVISA en la región y que, los cambios adaptativos presentes en los hVISA parecen ser conservados entre linajes como el ST5, los cuales afectan principalmente sistemas reguladores, autolisinas y factores de virulencia.Ítem Caracterización clínica, histológica y microbiológica de caries dental radicular en personas adultas mayores(2022) Úsuga Vacca, Margarita Viviana; Martignon Biermann, Stefania; Castellanos Parra, Jaime Eduardo; Ricaurte Alejandro, Márquez Ortiz; Martínez-Mier, Esperanza Ángeles; Velandia Romero, Myriam Lucía; Usuga Vacca, Margarita Viviana [0000-0003-2292-037X]El objetivo de este estudio fue determinar, para caries radicular, características operativas de métodos diagnósticos (Estudio-1); de asociación comportamental/clínico-patológica, (Estudio-2), y microbiológicas (Estudio-3). Estudio-1. Métodos diagnósticos valorados secuencialmente (1 examinador; n=125 superficies radiculares dentales): ICDAS (Sano-n=20; Caries-Inicial-n=49; Caries-Moderada-n=36; Caries-Severa-n=20); Óptico: Fluorescencia-cuantitativa-inducida-luz (QLF) (pérdida: Profundidad-∆F-%;); Histológicos: Microtomografía-computarizada (Micro-CT) (nsubmuestra-superficies=24); en secciones transversales (80-120 μm; n=140): Microscopía-de-luz-polarizada (PLM) y Estereomicroscopía (E) (ICDAS-radicular-histológico: ausencia, tercio-externo/-medio/-interno). Entre métodos (exceptuando QLF): Concordancia substancial-casi perfecta (Kappa: 0.62-0.98), con sensibilidad/especificidad altas (0.6-0.96/0.92-0.93) para ICDAS frente a pruebas histológicas; QLF vs. demás: concordancia muy-baja-débil (0.14-0.17) y baja exactitud (área-bajo-curva-ROC: <0.71, en los mejores puntos de corte). Estudio-2. Tres examinadores valoraron 226 adultos mayores institucionalizados (Bogotá): ICDAS-Activas/Inactivas, obturaciones, riesgo (Cariogram®), características individuales (cuestionario: demografía; antecedentes sistémicos; dentaduras; conocimientos/prácticas y calidad-de-vida-GOHAI). Edad promedio: 80.1±9.3 años (mujeres: 63.7%); prevalencias de: ICR (Índice-de-Caries-Radicular): 49.1%, ICDAS+obturaciones: 46% (2.03±2.78 superficies promedio), ICDAS-Activa: 40.3%, afección-sistémica: 94.2%; cuidado-oral-asistido: 58%. Asociación significativa (modelos-multivariados; p<0.05): caries-radicular/caries-radicular-activa vs. caries-coronal, hombre, >14 dientes, raíces-expuestas, ≥25g azúcares/día y <2 cepillados/día; asociación intermedia (análisis-de-componentes-principales; p<0.05) en presencia de caries activa: calidad-de-vida vs. prácticas-de-cuidado y motivo-de-consulta. Estudio-3. Se identificó microbioma de biopelícula radicular (n=42 participantes Estudio-2: n=130; Sana-n=45; Caries-Iniciales-Activas-n=18; Caries-Inicial-Inactiva-n=23; Caries-Moderada/Extensa-Activa-n=42; Caries-Moderada-Inactiva-n=2). Se amplificó, secuenció (Illumina-MiSeq) y analizó región V4-16S-rARN para identificación del microbioma. Asignación taxonómica ASVs (>1% abundancia, base-de-datos HOMD), análisis de diversidad (riqueza, índices Simpson/Shannon; Kruskal-Wallis; p<0.05): 5269 (género: 19; especie: 343), >Sano vs. Caries (2; p<0.05). El microbioma central fue altamente abundante en géneros: Streptococcus, Leptotrichia, Fusobacterium, Prevotella, Veillonella, Selenomonas; mayor riqueza de especies en sanos (p<0.05); mayor abundancia relativa de especies: Sano: Porfiromona pasteri, Lechtotricia wadei, Cardiobacterium valvarum y Campylobacter gracilis; Caries-Cavitacionales: Prevotella denticola y Caries-Activas: Prevotella denticola, Leptotrichia s.p. y Lactobacillus. Conclusiones: Para caries radicular, se validó ICDAS visual, frente a histogía; adultos mayores institucionalizados de Bogotá mostraron alta carga de caries y compleja composición microbiana de su biopelícula.