El sistema LiaFSR y resistencia a los péptidos antimicrobianos en enterococo
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Fecha
2018
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Universidad El Bosque
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Resumen
La envoltura celular es la primera línea de defensa bacteriana contra amenazas del medio ambiente, además de brindar a la célula su forma también participa en contrarrestar la presión osmótica interna y provee una interface sensorial y molecular entre la bacteria y el medio ambiente mediando el transporte controlado de solutos y el flujo de información. Por lo tanto, vigilar la integridad de la envoltura celular es una función vital para la supervivencia bacteriana. En consecuencia, debido al papel que desempeña en la homeóstasis bacteriana, esta constituye un blanco crítico para la acción de varios antibióticos usados en la práctica clínica. La daptomicina (DAP) es un antibiótico lipopéptido cíclico, relacionado estructuralmente a los péptidos catiónicos humanos. En su mecanismo de acción son relevantes la interacción con el calcio y los fosfolípidos de la membrana. DAP interfiere con la organización de lípidos en la membrana afectando múltiples procesos celulares, además de causar la disociación de proteínas de membrana periféricas esenciales. El sistema LiaFSR es un sistema de tres componentes conservado en bacterias patógenas Gram positivas del genero Firmicutes (bacterias con bajo contenido en GC). Este sistema de tres componentes está constituido por las proteínas LiaS (funciona como sensor/ histidina quinasa), LiaR (regulador de respuesta) y una proteína accesoria, LiaF (que ha sido caracterizada como un regulador negativo o positivo del sistema LiaFSR en ciertas especies bacterianas). El sistema desempeña un papel importante en la homeóstasis y la respuesta al estrés de la envoltura celular bacteriana en bacterias Gram Positivas. Particularmente, dos grupos de genes se han asociado con el mecanismo molecular de resistencia a DAP en enterococos: cambios genéticos en i) genes que codifican para el sistema regulatorio de tres componentes LiaFSR (descrito anteriormente) y ii) genes que codifican para enzimás involucradas en el metabolismo de fosfolípidos (p. ej., gdpD glicerolfosforildiester-fosfodiesterasa y cls cardiolipina sintetasa, entre otros). Sustituciones en LiaFSR parecen ser los primeros eventos vitales en la evolución de la resistencia a DAP en enterococos y posiblemente a adaptaciones de la membrana celular que tiene como consecuencia cambios en la arquitectura de fosfolipidos de la misma. El papel crítico de LiaR en la respuesta adaptativa de la membrana bacteriana de enterococos frente a DAP, se establecio al deleciónar el gen que codifica para el regulador de respuesta, lo que causó un revertimiento total de la susceptibilidad a DAP en enterococos, y aún más notable la observación del incremento en la susceptibilidad a péptidos catiónicos humanos y la restauración de la arquitectura normal de los microdominios de fosfolípidos aniónicos en la membrana de E. faecalis. Estudios biofísicos y cristalográficos han demostrado que la activación de LiaR por fosforilación o por mutaciones que imitan el estado fosforilado, promovió cambios conformacionales de la proteína que aumentaron su afinidad por los promotores blanco liaFSR y liaXYZ, causando una activación del sistema. La función de los genes liaXYZ es desconocida, pero algunos presentan homología con algunos componentes de un sistema involucrado en la respuesta adaptativa frente al estrés de la membrana celular en bacterias Gram negativas. De esta manera, LiaR, el regulador maestro que coordina los mecanismos que conducen a preservar la respuesta a estrés de la envoltura celular en enterococo constituye un blanco atractivo para el desarrollo de estrategias antimicrobianas que inhiban su funcionalidad y de esta manera afecten la viabilidad bacteriana y potencialmente fomenten la actividad del sistema inmune innato. Dedido a la importancia del sistema LiaFSR y sus genes efectores en los mecanismos de adaptación de la membrana celular en la resistencia a DAP y a péptidos antimicrobianos en enterococcos, esta investigación busco caracterizar el papel del sistema LiaFSR en resistencia a DAP in vivo y el efecto en la actividad del sistema inmune innato. Esta caracterización brindo los siguientes resultados que indicaron:i) LiaF es muy posiblemente un activador del sistema LiaFSR; ii) El grupo de genes liaXYZ son efectores importantes del sistema y la deleción de LiaR causó una importante represión en la transcripción de los mismos; iii) El nuevo modelo de C. elegans desarrollado en este trabajo es ideal para caracterizar el efecto in vivo de liaR en la presencia de DAP; iv) Los resultados obtenidos en C. elegans con DAP son reproducibles en un modelo de peritonitis de raton en E. faecalis y E. faecium; v) La deleción de liaR en enterococos afecta la habilidad de la bacteria para desarrollar resistencia a antiobiótico y vi) Alteraciones del sistema LiaFSR afectan la habilidad de los neutrófilos en destruir cepas de enterococos, incluyendo aquellas que presentan multiresistencia a antibióticos.Este trabajo sienta las bases para desarrollar el concepto de antibióticos que afectan la adaptacion membranal con el desarrollo de un modelo simple y escalable in vivo. Adicionalmente, pudimos comprobar que alteraciones de la homeóstasis de la membrana también mejora la actividad del sistema inmune innato en destruir patógenos, un concepto novedoso antimicrobiano.
Descripción
Abstract
Multidrug resistant enterococci are an important cause of healthcare associated infections with limited therapeutic alternatives. Daptomycin (DAP), a lipopeptide antibiotic that targets the Gram-positive bacterial cell membrane (CM), has become a front-line agent for severe enterococal infections. Recent studies indicate that DAP sequesters fluid membrane lipids, leading to alterations in membrane rigidity and delocalization of essential peripheral membrane proteins, thus inhibiting cell envelope synthesis and disrupting the integrity of the membrane. The emergence of resistance to DAP therapy is a growing concern, and has been linked to mutations in LiaFSR, a system that orchestrates cell-membrane homeóstasis in enterococci. The system is composed of three proteins, LiaR, the response regulator, LiaS, the histidine kinase, and LiaF, an accessory protein which is thought to play a regulatory role in the response to stress on the bacterial envelope. Amino acid substitutions in the regulatory components of the LiaFSR network have been associated with DAP resistance in enterococci. Deletion of the gene encoding LiaR, the response regulator, has been shown to restore susceptibility to DAP and human antimicrobial peptides (hAMP) in vitro. Moreover, deletion of an isoleucine in the C-terminal region of LiaF was associated with DAP resistance, also this genetic change resulted in redistribution of microdomains enriched in anionic phospholipids (PLs) in the (CM) and DAP tolerance in E. faecalis.Furthermore, in silico analysis and mutagenesis studies suggest that components of the cluster liaXYZ are the most relevant effector genes of LiaR, playing roles in the remodeling of cell membrane to protect them against the antimicrobial peptide attack. In the present work, we sought to i) study the role of LiaF and its interactions with members of the LiaFSR system, ii) investigate the transcriptional and physical link between LiaR and other components of the LiaFSR system, iii) evaluate the impact of LiaR on DAP therapy against E. faecalis and E. faecium using in vivo models of infection in Caernorhabditis elegans and mouse peritonitis, iv) evaluate the effect of liaR deletions on development of resitance in vivo, and iv) characterize the role of LiaR in interactions of enterococci with human PMNs using fluorescent phagocytosis and bactericidal assays. Our results indicate that the liaXYZ cluster is the most relevant target of LiaR and that LiaF is likely an activator of the system with a region in the C-terminal domain playing a major role. A potential physical interaction between LiaF and LiaS mediating this effect was identified. We provide in vivo data that suggest that targeting LiaR is a viable antimicrobial strategy that restores the activity of antimicrobials, increase the ability of the immune system to clear infecting bacteria and decreases the likelihood of developing resistance in vivo during therapy.
Palabras clave
Daptomicina, LiaFSR, LiaXYZ, Fagocitosis, Caenorhabditis elegans
Keywords
Daptomycin, Human antimicrobial peptides, LiaFSR, LiaXYZ, Caernorhabditis elegans