Estrategia para la confirmación de casos de dengue, su clasificación y pronóstico: aportes de algunos marcadores serológicos y celulares
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2023
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Resumen
Dengue es la arbovirosis humana de importancia en la salud pública en el mundo. La infección involucra la interacción de componentes del virus y factores del hospedero, los cuales se relacionan con un amplio espectro clínico que dificultan la identificación temprana de los casos. La infección induce variaciones en los niveles de algunas proteínas que pueden estar relacionados con el pronóstico y la severidad. Estos marcadores biológicos -o biomarcadores-, son moléculas liberadas por las células como citocinas, quimiocinas, anticuerpos, proteínas constitutivas de la membrana plasmática que pueden afectar la integridad de tejidos como el endotelio. En la patogénesis de dengue, se produce una respuesta caracterizada por la liberación de moléculas que tienen efecto en la activación de células, e inducen cambios en la arquitectura y función de diferentes tejidos. El endotelio representa el principal tejido afectado y cumple un papel esencial favoreciendo la adherencia, permeabilidad y activación de células inmunes. Su alteración ha sido estudiada en procesos inflamatorios sistémicos en los que se ha analizado el efecto de la proteína de alta movilidad del grupo 1 (HMGB1) en la activación y disfunción, y su relación con la severidad. El objetivo del estudio fue establecer una estrategia para la confirmación de casos de dengue y definir el aporte de algunos biomarcadores serológicos y celulares para su clasificación y pronóstico. Por lo tanto, el trabajo integró el estudio de tres componentes esenciales en la infección por DENV, en el primero se realizó el análisis de variables clínicas y de laboratorio para el diseño de un algoritmo diagnóstico en la confirmación de casos de dengue. El segundo integró la medición de marcadores biológicos en muestras de individuos febriles, para identificar su utilidad en el diagnóstico y el pronóstico; el tercer componente, se centró en la activación y disfunción del endotelio y la exploración del papel que desempeña la proteína HMGB1 liberada por PBMCs durante la infección por DENV. El primer componente del estudio analizó 505 muestras de individuos con síndrome febril agudo mediante la aplicación de pruebas de diagnóstico rápido (PDR) -IgM e IgG y NS1-, y pruebas de ELISA de captura -IgM, IgG y NS1-, y RT-PCR. Se identificó que la sensibilidad, especificidad, valores predictivos y área bajo la curva (AUC) de las PDR fue inferior respecto al estándar (ELISA IgM Positivo o PCR positivo) al igual que las pruebas de ELISA. El análisis basado en la combinación de dos pruebas, aumentó la sensibilidad y especificidad entre 35% hasta el 50%. La inclusión de variables clínicas y hematológicas en un análisis de regresión logística identificó su utilidad en el diagnóstico y la clasificación de los casos (DWoWS, DWS, SD) y febriles no dengue (OFI). Estas variables se consideraron en el diseño de árboles de decisión para determinar el porcentaje de confirmación de casos. El algoritmo que integró la combinación de PDR NS1 OR ELISA IgM con mialgias, dolor abdominal, plaquetas <140.000/mm3 detectó el 90.6% de los casos, mientras la combinación de PDR IgM OR PDR NS1 con variables clínicas y hematológicas, identificó el 81.6%. El primer algoritmo puede ser utilizado en instituciones de salud que cuentan con capacidad para su aplicación en el diagnóstico de rutina; mientras que el segundo, en instituciones de áreas endémicas por la combinación de pruebas accesibles y de bajo costo, que complementan la información clínica y permitiría realizar un diagnóstico y tratamiento oportuno. El segundo componente del trabajo se centró en evaluar algunos biomarcadores, en muestras de individuos con dengue, febriles no dengue, e individuos sin antecedente de infección por DENV. El análisis evaluó la asociación entre los niveles de estas moléculas y la severidad de la enfermedad. Los niveles de los biomarcadores analizados no presentaron elevación significativa al comparar los grupos de diagnóstico y la severidad. Se encontró una asociación moderada entre los niveles de HMGB1 y la edad, y los niveles de tropomiosina con el recuento de leucocitos y plaquetas en el grupo DWoWS. Nuestros hallazgos confirman la complejidad de la búsqueda de biomarcadores para establecer pronóstico, y resaltan la necesidad del estudio simultáneo de biomarcadores en diferentes fases de la enfermedad para identificar su dinámica y asociación con las manifestaciones clínicas. El tercer componente del trabajo evaluó la activación y disfunción del endotelio y el papel que podría desempeñar la proteína HMGB1. La estrategia aplicada incluyó la evaluación de un modelo de células endoteliales polarizadas, expuestas a sobrenadantes de PBMCs infectados por DENV2 (I – Mo), no infectados (NI – Mo) o la proteína HMGB1 recombinante. Para identificar si los cambios en el endotelio fueron producidos por HMGB1 u otros factores, se consideró la evaluación de tres condiciones de neutralización. La primera dirigida contra HMGB1, la segunda la inhibición de los receptores de esta proteína (TLR4 y la combinación RAGE-TLR4), y la tercera la neutralización de tres citocinas (TNF-α, IL-6 e IL-8). Se identificó que las EC expuestas a los sobrenadantes I - Mo liberan HMGB1 entre otras moléculas, indujeron cambios en el endotelio caracterizados por un perfil inflamatorio temprano, sin afectar la viabilidad celular. La inhibición directa e indirecta evidenció que disminución en la TEER, variación en la permeabilidad, aumento en la expresión de mRNA y la expresión y localización de proteínas, son debidos al efecto conjunto de HMGB1 con otras moléculas. Estos hallazgos demuestran que los estímulos I – Mo y rHMGB1 están relacionados con la activación temprana del endotelio, los cambios morfológicos, y la alteración de la continuidad de las células. Podemos concluir que la activación y el daño endotelial son producto de la actividad de HMGB1 como alarmina, lo cual evidencia una cinética diferente durante el curso de la infección. Este efecto conduce a que la búsqueda de biomarcadores se convierta en un panorama complejo de interpretación, que requiere de una exploración de estrategias para la determinación del momento específico en el que presentan las manifestaciones clínicas asociadas a severidad y variaciones en los biomarcadores, conduciendo a la correcta interpretación de estos parámetros, y conduzcan a que la aplicación de algoritmos de diagnóstico tengan un alto desempeño en la detección y confirmación de los casos, demostrando su eficacia en la aplicación en una población específica.
Descripción
Abstract
Dengue virus is the most important arboviral pathogens affecting humans worldwide. Infection involves the interaction of virus components and host factors, which are associated with a broad clinical spectrum that makes difficult early identification of dengue cases. Infection induces changes in the levels of some proteins that may be related to severity. These biological markers -also known as biomarkers-, are molecules released by infected and activated cells such as cytokines, chemokines, antibodies, proteins from cell membrane involved in the integrity of tissues such as the endothelium. Dengue pathogenesis is characterized by the release of molecules that are related to cellular activation, inducing changes in the integrity and function of different tissues. The endothelium represents the main tissue affected and plays an essential role in supporting the adhesion, activation, and migration of immune cells. Endothelial activation and dysfunction has been studied in systemic inflammatory processes in which the effect of the high mobility group box protein (HMGB1) has been analyzed. The aim of the study was to establish a strategy to confirm dengue cases and define the contribution of some serological and cellular biomarkers for their classification and prognosis. This work integrated the study of three essential components in DENV infection. The first component involved the analysis of clinical and laboratory variables to design a diagnostic algorithm to confirm dengue cases. The second integrated the measurement of biomarkers in samples from patients with febrile syndrome to identify their usefulness in dengue diagnosis. Third component focused on endothelial activation and dysfunction and explore the role of HMGB1 released by infected and activated cells during DENV infection. The first component of the study tested 505 samples from suspected cases of DENV infection using rapid diagnostic tests (RDTs) - IgM and IgG and NS1, capture ELISA tests - IgM, IgG and NS1-, and RT-PCR. The Sensitivity, specificity, predictive values, and area under the curve (AUC) obtained for of RDTs were lower than the standard reference (IgM ELISA positive OR PCR positive), as values obtained for ELISA tests. Statistical analysis based on combination of two test applied, increase the percentage of sensitivity and specificity between 35% to 50%. Furthermore, the inclusion of clinical and hematological variables in a logistic regression analysis identified their effect on the diagnosis and classification of cases according to disease severity (DWoWS, DWS, SD) and other febrile illness (OFI). These variables were considered in the design of decision trees, to determine the percentage of confirmed DENV cases. The algorithm that integrated the combination of PDR NS1 OR ELISA IgM with myalgias, abdominal pain, platelets <140,000/mm3 detected 90.6% of cases, while the combination of PDR IgM OR PDR NS1 with clinical and hematological variables identified 81.6%. The first algorithm can be used in health institutions that can apply it in routine diagnosis; the second algorithm can be used in health institutions from endemic areas due to the combination of accessible and low-cost diagnostic tests, which complement clinical information and allow for timely diagnosis and treatment. The second component of the study focused on the assessment of some biomarkers in samples from patients with dengue, other febrile illness, and health subjects -without history of DENV infection-. The analysis assessed the association between biomarkers levels and disease severity. We observed that biomarkers levels were not significantly elevated when comparing diagnosis and classification of disease severity. A moderate association was found between HMGB1 levels and age, and tropomyosin levels with leukocyte and platelet counts in DWoWS group. Our findings confirm the complexity of the search for biomarkers to establish disease prognosis and highlight the need to study simultaneously at different times of infection, identify their dynamic and association with clinical manifestations. The third component assessed endothelial activation and dysfunction and the role of the HMGB1 protein. The strategy applied included the evaluation of polarized endothelial cells (ECs) exposed to supernatants of DENV2-infected PBMCs (EC + I - Mo), supernatants from non-infected PBMCs (NI - Mo) and EC exposed to recombinant HMGB1 protein. To identify whether endothelial changes were produced by HMGB1 or other factors, we considered the evaluation of three neutralizing conditions, the first aimed to inhibit HMGB1, the second focused on the neutralization of HMGB1 receptors (using TLR4 and the combination of RAGE and TLR4 antibodies), and third directed to neutralize three cytokines TNF-α, IL-6 and IL-8, through their specific antibodies. We found that ECs exposed to I - Mo supernatants released HMGB1 among other molecules, and endothelial changes were characterized by an early inflammatory profile, without affecting cell viability. Direct and indirect neutralization of HMGB1 showed that TEER decrease, changes in permeability, increased mRNA expression and protein localization and expression were due to the combined effect of HMGB1 with other molecules. These findings demonstrate that I - Mo and rHMGB1 stimuli are related to early endothelial activation, morphological changes, and altered cell continuity. In conclusion, endothelial activation and dysfunction resulted from the activity of HMGB1 as an alarmin, showing a different kinetic during the course of DENV infection. This effect leads to the search for biomarkers becoming a complex landscape of interpretation, requiring an exploration of strategies for measuring these molecules in specific times where patients develop severe clinical manifestations, leading to an understanding of the differences in these markers, and encourage the evaluation and implementation of the algorithms with high performance in the dengue cases detection, demonstrating the efficacy of their application in specific populations.
Palabras clave
Dengue, Diagnóstico, Confirmación de caso, Biomarcadores, HMGB1, Patogénesis, Endotelio
Keywords
Dengue, Diagnosis, Case confirmation, Biomarkers, HMGB1, Pathogenesis, Endothelium