Implementación del ensayo de 2′,7′-Diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA) para la evaluación de estrés oxidativo intracelular en modelos in vitro de cáncer colorrectal y seno

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dc.contributor.advisorMorantes Medina, Sandra Johanna
dc.contributor.advisorDelgado Tiria, Félix Giovanni
dc.contributor.authorOrtiz Machuca, Diana Valentina
dc.contributor.authorRamirez Montenegro, David Felipe
dc.contributor.orcidRamirez Montenegro, David Felipe [0000-0002-1469-7377]
dc.contributor.orcidOrtiz Machuca, Diana Valentina [0000-0001-5982-1936]
dc.date.accessioned2022-11-28T16:29:51Z
dc.date.available2022-11-28T16:29:51Z
dc.date.issued2022
dc.description.abstractLas especies reactivas de oxígeno (ROS) son subproductos naturales del metabolismo oxidativo, y juegan un papel importante a nivel celular en la modulación de la homeostasis redox. El ensayo de 2'-7'-Diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA) es empleado con frecuencia para cuantificar la producción de ROS intracelular, por ser económico, sencillo y reproducible. El reactivo se encuentra en forma de éster, un compuesto relativamente polar y permeable a la membrana, que se hidroliza por las esterasas celulares para ser convertido en diclorodihidrofluoresceina (DCFH), un compuesto no fluorescente y polar, que será oxidado en presencia de las ROS, convirtiéndose a 2',7'-diclorofluoresceína (DCF), un producto altamente fluorescente que se acumula en la célula. Pese al amplio uso de este ensayo para determinar estrés oxidativo, se han reportado diferentes condiciones experimentales que condicionan una correcta cuantificación de ROS intracelular. Teniendo en cuenta esto, en este trabajo se establecieron las condiciones óptimas para inducir y cuantificar estrés oxidativo empleando el ensayo DCFH-DA. Como modelo de estudio se emplearon las líneas celulares MCF-7 y HT-29, evaluando el efecto de dos inductores de ROS (H2O2 y doxorrubicina). Por medio de fluorometría se evaluó el efecto de la concentración del inductor, el tiempo de reacción y el medio de disolución del ensayo. Los resultados obtenidos sugieren que el H2O2 es un mayor inductor de ROS en MCF-7, aumentando la producción de ROS 1,96 veces respecto al control después de 24 horas a 0,04 %v/v. Este mismo incremento se observó en HT-29 pero usando H2O2 a 0,16 %v/v, mostrando diferencias estadísticamente significativas respecto al control (Kruskal-Wallis post-hoc mann Whitney con un P< 0,05). Adicionalmente, se demostró que la cuantificación de ROS se ve afectada por la exposición a la luz, se debe usar PBS como medio de disolución y tiempos de reacción no mayores a 30 minutos. El ensayo se estandarizó para medir estrés oxidativo intracelular en ambas líneas celulares, obteniendo resultados reproducibles basados en la normalización por concentración de proteína. Finalmente, se estructuró un protocolo que será de gran utilidad para evaluar la actividad oxidante o prooxidante de sustancias exógenas en investigaciones que lo requieran, este protocolo también podrá ser empleado para el tamizaje in vitro de sustancias antioxidantes.spa
dc.description.abstractenglishReactive oxygen species (ROS) are natural by-products of oxidative metabolism, and play an important role at the cellular level in modulating redox homeostasis. The 2'-7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) assay is frequently employed to quantify intracellular ROS production because it is inexpensive, simple and reproducible. The reagent is in the form of an ester, a relatively polar and membrane-permeable compound, which is hydrolyzed by cellular esterases to dichlorodihydrofluorescein (DCFH), a non-fluorescent and polar compound, which will be oxidized in the presence of ROS, converting to 2',7'-dichlorofluorescein (DCF), a highly fluorescent product that accumulates in the cell. Despite the wide use of this assay to determine oxidative stress, different experimental conditions have been reported that condition a correct quantification of intracellular ROS. Taking this into account, in this work we established the optimal conditions to induce and quantify oxidative stress using the DCFH-DA assay. MCF-7 and HT-29 cell lines were used as a study model, evaluating the effect of two ROS inducers (H2O2 and doxorubicin). By means of fluorometry, the effect of the concentration of the inducer, the reaction time and the dissolution medium of the assay were evaluated. The results obtained suggest that H2O2 is a major inducer of ROS in MCF-7, increasing ROS production 1.96-fold with respect to the control after 24 hours at 0.04 %v/v. This same increase was observed in HT-29 but using H2O2 at 0.16 %v/v, showing statistically significant differences with respect to the control (Kruskal-Wallis post-hoc mann Whitney with a P< 0.05). Additionally, it was demonstrated that ROS quantification is affected by exposure to light, PBS should be used as dissolution medium and reaction times no longer than 30 minutes. The assay was standardized to measure intracellular oxidative stress in both cell lines, obtaining reproducible results based on normalization by protein concentration. Finally, a protocol was structured that will be very useful to evaluate the oxidant or prooxidant activity of exogenous substances in investigations that require it; this protocol can also be used for in vitro screening of antioxidant substances.eng
dc.description.degreelevelPregradospa
dc.description.degreelevelQuímico Farmacéuticospa
dc.format.mimetypeapplication/pdf
dc.identifier.instnameUniversidad El Bosquespa
dc.identifier.reponameRepositorio Institucional Universidad El Bosquespa
dc.identifier.repourlhttps://repositorio.unbosque.edu.co
dc.identifier.urihttps://hdl.handle.net/20.500.12495/9316
dc.language.isospa
dc.publisher.facultyFacultad de Cienciasspa
dc.publisher.grantorUniversidad El Bosquespa
dc.publisher.programQuímica Farmacéuticaspa
dc.rightsAtribución-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional*
dc.rights.accessrightsinfo:eu-repo/semantics/openAccess
dc.rights.accessrightshttps://purl.org/coar/access_right/c_abf2
dc.rights.localAcceso abiertospa
dc.rights.urihttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/*
dc.subjectEstrés oxidativospa
dc.subjectCáncerspa
dc.subjectROSspa
dc.subjectDCFH-DAspa
dc.subjectFármacos antitumoralesspa
dc.subjectHT-29spa
dc.subjectMCF-7spa
dc.subject.ddc615.19
dc.subject.keywordsOxidative stressspa
dc.subject.keywordsCancerspa
dc.subject.keywordsROSspa
dc.subject.keywordsDCFH-DAspa
dc.subject.keywordsAntitumor drugsspa
dc.subject.keywordsHT-29spa
dc.subject.keywordsMCF-7spa
dc.titleImplementación del ensayo de 2′,7′-Diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA) para la evaluación de estrés oxidativo intracelular en modelos in vitro de cáncer colorrectal y senospa
dc.title.translatedImplementation of the 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) assay for the assessment of intracellular oxidative stress in in vitro models of colorectal and breast cancerspa
dc.type.coarhttps://purl.org/coar/resource_type/c_7a1f
dc.type.coarversionhttps://purl.org/coar/version/c_ab4af688f83e57aa
dc.type.driverinfo:eu-repo/semantics/bachelorThesis
dc.type.hasversioninfo:eu-repo/semantics/acceptedVersion
dc.type.localTesis/Trabajo de grado - Monografía - Pregrado

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