Implementación del ensayo de 2′,7′-Diclorodihidrofluoresceina diacetato (DCFH-DA) para la evaluación de estrés oxidativo intracelular en modelos in vitro de cáncer colorrectal y seno
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2022
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Resumen
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son subproductos naturales del metabolismo oxidativo, y juegan un papel importante a nivel celular en la modulación de la homeostasis redox. El ensayo de 2'-7'-Diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA) es empleado con frecuencia para cuantificar la producción de ROS intracelular, por ser económico, sencillo y reproducible. El reactivo se encuentra en forma de éster, un compuesto relativamente polar y permeable a la membrana, que se hidroliza por las esterasas celulares para ser convertido en diclorodihidrofluoresceina (DCFH), un compuesto no fluorescente y polar, que será oxidado en presencia de las ROS, convirtiéndose a 2',7'-diclorofluoresceína (DCF), un producto altamente fluorescente que se acumula en la célula. Pese al amplio uso de este ensayo para determinar estrés oxidativo, se han reportado diferentes condiciones experimentales que condicionan una correcta cuantificación de ROS intracelular. Teniendo en cuenta esto, en este trabajo se establecieron las condiciones óptimas para inducir y cuantificar estrés oxidativo empleando el ensayo DCFH-DA. Como modelo de estudio se emplearon las líneas celulares MCF-7 y HT-29, evaluando el efecto de dos inductores de ROS (H2O2 y doxorrubicina). Por medio de fluorometría se evaluó el efecto de la concentración del inductor, el tiempo de reacción y el medio de disolución del ensayo. Los resultados obtenidos sugieren que el H2O2 es un mayor inductor de ROS en MCF-7, aumentando la producción de ROS 1,96 veces respecto al control después de 24 horas a 0,04 %v/v. Este mismo incremento se observó en HT-29 pero usando H2O2 a 0,16 %v/v, mostrando diferencias estadísticamente significativas respecto al control (Kruskal-Wallis post-hoc mann Whitney con un P< 0,05). Adicionalmente, se demostró que la cuantificación de ROS se ve afectada por la exposición a la luz, se debe usar PBS como medio de disolución y tiempos de reacción no mayores a 30 minutos. El ensayo se estandarizó para medir estrés oxidativo intracelular en ambas líneas celulares, obteniendo resultados reproducibles basados en la normalización por concentración de proteína. Finalmente, se estructuró un protocolo que será de gran utilidad para evaluar la actividad oxidante o prooxidante de sustancias exógenas en investigaciones que lo requieran, este protocolo también podrá ser empleado para el tamizaje in vitro de sustancias antioxidantes.
Descripción
Abstract
Reactive oxygen species (ROS) are natural by-products of oxidative metabolism, and play an important role at the cellular level in modulating redox homeostasis. The 2'-7'-Dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA) assay is frequently employed to quantify intracellular ROS production because it is inexpensive, simple and reproducible. The reagent is in the form of an ester, a relatively polar and membrane-permeable compound, which is hydrolyzed by cellular esterases to dichlorodihydrofluorescein (DCFH), a non-fluorescent and polar compound, which will be oxidized in the presence of ROS, converting to 2',7'-dichlorofluorescein (DCF), a highly fluorescent product that accumulates in the cell. Despite the wide use of this assay to determine oxidative stress, different experimental conditions have been reported that condition a correct quantification of intracellular ROS. Taking this into account, in this work we established the optimal conditions to induce and quantify oxidative stress using the DCFH-DA assay. MCF-7 and HT-29 cell lines were used as a study model, evaluating the effect of two ROS inducers (H2O2 and doxorubicin). By means of fluorometry, the effect of the concentration of the inducer, the reaction time and the dissolution medium of the assay were evaluated. The results obtained suggest that H2O2 is a major inducer of ROS in MCF-7, increasing ROS production 1.96-fold with respect to the control after 24 hours at 0.04 %v/v. This same increase was observed in HT-29 but using H2O2 at 0.16 %v/v, showing statistically significant differences with respect to the control (Kruskal-Wallis post-hoc mann Whitney with a P< 0.05). Additionally, it was demonstrated that ROS quantification is affected by exposure to light, PBS should be used as dissolution medium and reaction times no longer than 30 minutes. The assay was standardized to measure intracellular oxidative stress in both cell lines, obtaining reproducible results based on normalization by protein concentration. Finally, a protocol was structured that will be very useful to evaluate the oxidant or prooxidant activity of exogenous substances in investigations that require it; this protocol can also be used for in vitro screening of antioxidant substances.
Palabras clave
Estrés oxidativo, Cáncer, ROS, DCFH-DA, Fármacos antitumorales, HT-29, MCF-7
Keywords
Oxidative stress, Cancer, ROS, DCFH-DA, Antitumor drugs, HT-29, MCF-7