Postgrados

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https://hdl.handle.net/20.500.12495/153

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Examinando Postgrados por Autor "Balbás Tepedino, Arturo Gabriel"

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    Evaluación de la producción de exosomas en macrófagos humanos U-937 infectados con el DENV-2
    Balbás Tepedino, Arturo Gabriel; Velandia-Romero, Myriam Lucía
    Los exosomas son vesículas secretadas por diferentes tipos celulares y contienen en su interior moléculas bioactivas que pueden modificar el comportamiento de la célula receptora. Hay evidencia que muestra que varios virus utilizan estas vesículas para transportar factores como proteínas, RNA y miRNA que favorecen el establecimiento de una infección productiva y/o modulan la respuesta celular. El objetivo de este trabajo fue evaluar la producción de exosomas de macrófagos U-937 infectados con el DENV-2 y caracterizar su contenido. Macrófagos adherentes U-937 se infectaron con el virus dengue serotipo 2 (DENV-2) a una MOI de 0,2 y se mantuvieron en el medio definido BIO-MPM-1 durante 96-120 horas, como control negativo se mantuvieron con el mismo medio células no infectadas. Al finalizar el tiempo post-infección se recolectaron los sobrenadantes y las vesículas se aislaron por ultrafiltración y ultracentrifugación y se caracterizaron por microscopía electrónica de transmisión (TEM), SDS-PAGE, Western Blot y espectrometría de masas. También, se cuantificó la concentración de proteína y la actividad de acetilcolinesterasa, se determinó la densidad en gradientes de sacarosa, y se extrajeron los RNAs pequeños (sRNAs). Adicionalmente, se determinó la capacidad infecciosa de los exosomas mediante el análisis de focos infecciosos utilizando exosomas purificados por inmunoprecipitación e inoculados en células LLC-MK2. A las 120 hpi el porcentaje de infección fue 75% con una viabilidad celular del 80%. De acuerdo a la cuantificación de proteínas y a la actividad de AChT la infección con DENV-2 no afectó la producción ni secreción de los exosomas, Por TEM se detectaron vesículas esféricas en forma de copa de aproximadamente 100 nm, con una densidad de flotación entre 1,14 y 1,19 g/mL, estas vesículas fueron positivas para las proteínas del complejo ESCRT ALIX y TSG-101, la tetraspanina CD63 y la histona 3 (H3). Interesantemente los exosomas fueron positivos para la proteína viral NS3, la cual coincido con ALIX en exosomas con densidades entre 1,20 y 1,25 g/mL. Finalmente, de acuerdo al ensayo de focos, los exosomas secretados por las células infectadas no transportan partículas virales ni RNA infeccioso, sin embargo, estas vesículas están enriquecidas con sRNA. El protocolo utilizado en este trabajo permitió obtener exosomas con alto grado de pureza con características físicas similares a las reportadas para estas vesículas en otros modelos celulares. La presencia de NS3 y de los sRNA en los exosomas secretados por los macrófagos infectados, podrían ser una estrategia para iniciar o modular la respuesta inmune en diferentes tipos celulares infectadas o no infectadas.