Evaluación de la producción de exosomas en macrófagos humanos U-937 infectados con el DENV-2
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Resumen
Los exosomas son vesículas secretadas por diferentes tipos celulares y contienen en su interior moléculas bioactivas que pueden modificar el comportamiento de la célula receptora. Hay evidencia que muestra que varios virus utilizan estas vesículas para transportar factores como proteínas, RNA y miRNA que favorecen el establecimiento de una infección productiva y/o modulan la respuesta celular. El objetivo de este trabajo fue evaluar la producción de exosomas de macrófagos U-937 infectados con el DENV-2 y caracterizar su contenido. Macrófagos adherentes U-937 se infectaron con el virus dengue serotipo 2 (DENV-2) a una MOI de 0,2 y se mantuvieron en el medio definido BIO-MPM-1 durante 96-120 horas, como control negativo se mantuvieron con el mismo medio células no infectadas. Al finalizar el tiempo post-infección se recolectaron los sobrenadantes y las vesículas se aislaron por ultrafiltración y ultracentrifugación y se caracterizaron por microscopía electrónica de transmisión (TEM), SDS-PAGE, Western Blot y espectrometría de masas. También, se cuantificó la concentración de proteína y la actividad de acetilcolinesterasa, se determinó la densidad en gradientes de sacarosa, y se extrajeron los RNAs pequeños (sRNAs). Adicionalmente, se determinó la capacidad infecciosa de los exosomas mediante el análisis de focos infecciosos utilizando exosomas purificados por inmunoprecipitación e inoculados en células LLC-MK2. A las 120 hpi el porcentaje de infección fue 75% con una viabilidad celular del 80%. De acuerdo a la cuantificación de proteínas y a la actividad de AChT la infección con DENV-2 no afectó la producción ni secreción de los exosomas, Por TEM se detectaron vesículas esféricas en forma de copa de aproximadamente 100 nm, con una densidad de flotación entre 1,14 y 1,19 g/mL, estas vesículas fueron positivas para las proteínas del complejo ESCRT ALIX y TSG-101, la tetraspanina CD63 y la histona 3 (H3). Interesantemente los exosomas fueron positivos para la proteína viral NS3, la cual coincido con ALIX en exosomas con densidades entre 1,20 y 1,25 g/mL. Finalmente, de acuerdo al ensayo de focos, los exosomas secretados por las células infectadas no transportan partículas virales ni RNA infeccioso, sin embargo, estas vesículas están enriquecidas con sRNA. El protocolo utilizado en este trabajo permitió obtener exosomas con alto grado de pureza con características físicas similares a las reportadas para estas vesículas en otros modelos celulares. La presencia de NS3 y de los sRNA en los exosomas secretados por los macrófagos infectados, podrían ser una estrategia para iniciar o modular la respuesta inmune en diferentes tipos celulares infectadas o no infectadas.
Descripción
Abstract
Exosomes are vesicles secreted by different cell types and contain in their interior bioactive molecules that can modify the behavior of the receptor cell. There is evidence that several viruses use these vesicles to transport factors such as proteins, RNA and miRNA that favor the establishment of a productive infection and/or modulate the cellular response. The objective of this work was to evaluate the production of exosomes of U-937 macrophages infected with DENV-2 and to characterize its content. Adherent macrophages U-937 were infected with the dengue virus serotype 2 (DENV-2) at an MOI of 0.2 and were maintained in the defined medium BIO-MPM-1 for 120 hours. At the end of the post-infection time, the supernatants were collected and the vesicles were isolated by ultrafiltration and ultracentrifugation and characterized by transmission electron microscopy (TEM), SDS-PAGE, Western Blot and mass spectrometry. Also, protein concentration and acetylcholinesterase activity were quantified, density was determined in sucrose gradients, and small RNAs (sRNAs) were extracted. Additionally, the infectious capacity of the exosomes was determined by the analysis of infectious foci using exosomes purified by immunoprecipitation and inoculated in LLC-MK2 cells. At 120 hpi the percentage of infection was 75% with a cell viability of 80%. According to protein quantification and AChT activity, infection with DENV-2 did not affect the production or secretion of the exosomes. By TEM, cup-shaped spherical vesicles of approximately 100 nm were detected, with a density of flotation between 1,14 and 1,19 g/mL, these vesicles were positive for the ESCRT ALIX and TSG-101 complex proteins, tetraspanin CD63 and histone 3 (H3). Interestingly, the exosomes were positive for the NS3 viral protein, which coincides with ALIX in exosomes with densities between 1,20 and 1,25 g/mL. Finally, according to the foci assay, the exosomes secreted by the infected cells do not carry viral particles or infectious RNA, however, these vesicles are enriched with sRNA. The protocol used in this study allowed obtaining exosomes with a high degree of purity with physical characteristics similar to those reported for these vesicles in other cellular models. The presence of NS3 and sRNA in exosomes secreted by infected macrophages could be a strategy to initiate or modulate the immune response in different infected or uninfected cell types.