Doctorado en Ciencias Biomédicas

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https://hdl.handle.net/20.500.12495/159

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Examinando Doctorado en Ciencias Biomédicas por Autor "Velandia Romero, Myriam Lucía"

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    Caracterización clínica, histológica y microbiológica de caries dental radicular en personas adultas mayores
    (2022) Úsuga Vacca, Margarita Viviana; Martignon Biermann, Stefania; Castellanos Parra, Jaime Eduardo; Ricaurte Alejandro, Márquez Ortiz; Martínez-Mier, Esperanza Ángeles; Velandia Romero, Myriam Lucía; Usuga Vacca, Margarita Viviana [0000-0003-2292-037X]
    El objetivo de este estudio fue determinar, para caries radicular, características operativas de métodos diagnósticos (Estudio-1); de asociación comportamental/clínico-patológica, (Estudio-2), y microbiológicas (Estudio-3). Estudio-1. Métodos diagnósticos valorados secuencialmente (1 examinador; n=125 superficies radiculares dentales): ICDAS (Sano-n=20; Caries-Inicial-n=49; Caries-Moderada-n=36; Caries-Severa-n=20); Óptico: Fluorescencia-cuantitativa-inducida-luz (QLF) (pérdida: Profundidad-∆F-%;); Histológicos: Microtomografía-computarizada (Micro-CT) (nsubmuestra-superficies=24); en secciones transversales (80-120 μm; n=140): Microscopía-de-luz-polarizada (PLM) y Estereomicroscopía (E) (ICDAS-radicular-histológico: ausencia, tercio-externo/-medio/-interno). Entre métodos (exceptuando QLF): Concordancia substancial-casi perfecta (Kappa: 0.62-0.98), con sensibilidad/especificidad altas (0.6-0.96/0.92-0.93) para ICDAS frente a pruebas histológicas; QLF vs. demás: concordancia muy-baja-débil (0.14-0.17) y baja exactitud (área-bajo-curva-ROC: <0.71, en los mejores puntos de corte). Estudio-2. Tres examinadores valoraron 226 adultos mayores institucionalizados (Bogotá): ICDAS-Activas/Inactivas, obturaciones, riesgo (Cariogram®), características individuales (cuestionario: demografía; antecedentes sistémicos; dentaduras; conocimientos/prácticas y calidad-de-vida-GOHAI). Edad promedio: 80.1±9.3 años (mujeres: 63.7%); prevalencias de: ICR (Índice-de-Caries-Radicular): 49.1%, ICDAS+obturaciones: 46% (2.03±2.78 superficies promedio), ICDAS-Activa: 40.3%, afección-sistémica: 94.2%; cuidado-oral-asistido: 58%. Asociación significativa (modelos-multivariados; p<0.05): caries-radicular/caries-radicular-activa vs. caries-coronal, hombre, >14 dientes, raíces-expuestas, ≥25g azúcares/día y <2 cepillados/día; asociación intermedia (análisis-de-componentes-principales; p<0.05) en presencia de caries activa: calidad-de-vida vs. prácticas-de-cuidado y motivo-de-consulta. Estudio-3. Se identificó microbioma de biopelícula radicular (n=42 participantes Estudio-2: n=130; Sana-n=45; Caries-Iniciales-Activas-n=18; Caries-Inicial-Inactiva-n=23; Caries-Moderada/Extensa-Activa-n=42; Caries-Moderada-Inactiva-n=2). Se amplificó, secuenció (Illumina-MiSeq) y analizó región V4-16S-rARN para identificación del microbioma. Asignación taxonómica ASVs (>1% abundancia, base-de-datos HOMD), análisis de diversidad (riqueza, índices Simpson/Shannon; Kruskal-Wallis; p<0.05): 5269 (género: 19; especie: 343), >Sano vs. Caries (2; p<0.05). El microbioma central fue altamente abundante en géneros: Streptococcus, Leptotrichia, Fusobacterium, Prevotella, Veillonella, Selenomonas; mayor riqueza de especies en sanos (p<0.05); mayor abundancia relativa de especies: Sano: Porfiromona pasteri, Lechtotricia wadei, Cardiobacterium valvarum y Campylobacter gracilis; Caries-Cavitacionales: Prevotella denticola y Caries-Activas: Prevotella denticola, Leptotrichia s.p. y Lactobacillus. Conclusiones: Para caries radicular, se validó ICDAS visual, frente a histogía; adultos mayores institucionalizados de Bogotá mostraron alta carga de caries y compleja composición microbiana de su biopelícula.
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    Estrategia para la confirmación de casos de dengue, su clasificación y pronóstico: aportes de algunos marcadores serológicos y celulares
    (2023) Coronel Ruiz, Carolina; Velandia Romero, Myriam Lucía; Castellanos Parra, Jaime Eduardo; Coronel Ruiz, Carolina [0000-0003-2202-5682]
    Dengue es la arbovirosis humana de importancia en la salud pública en el mundo. La infección involucra la interacción de componentes del virus y factores del hospedero, los cuales se relacionan con un amplio espectro clínico que dificultan la identificación temprana de los casos. La infección induce variaciones en los niveles de algunas proteínas que pueden estar relacionados con el pronóstico y la severidad. Estos marcadores biológicos -o biomarcadores-, son moléculas liberadas por las células como citocinas, quimiocinas, anticuerpos, proteínas constitutivas de la membrana plasmática que pueden afectar la integridad de tejidos como el endotelio. En la patogénesis de dengue, se produce una respuesta caracterizada por la liberación de moléculas que tienen efecto en la activación de células, e inducen cambios en la arquitectura y función de diferentes tejidos. El endotelio representa el principal tejido afectado y cumple un papel esencial favoreciendo la adherencia, permeabilidad y activación de células inmunes. Su alteración ha sido estudiada en procesos inflamatorios sistémicos en los que se ha analizado el efecto de la proteína de alta movilidad del grupo 1 (HMGB1) en la activación y disfunción, y su relación con la severidad. El objetivo del estudio fue establecer una estrategia para la confirmación de casos de dengue y definir el aporte de algunos biomarcadores serológicos y celulares para su clasificación y pronóstico. Por lo tanto, el trabajo integró el estudio de tres componentes esenciales en la infección por DENV, en el primero se realizó el análisis de variables clínicas y de laboratorio para el diseño de un algoritmo diagnóstico en la confirmación de casos de dengue. El segundo integró la medición de marcadores biológicos en muestras de individuos febriles, para identificar su utilidad en el diagnóstico y el pronóstico; el tercer componente, se centró en la activación y disfunción del endotelio y la exploración del papel que desempeña la proteína HMGB1 liberada por PBMCs durante la infección por DENV. El primer componente del estudio analizó 505 muestras de individuos con síndrome febril agudo mediante la aplicación de pruebas de diagnóstico rápido (PDR) -IgM e IgG y NS1-, y pruebas de ELISA de captura -IgM, IgG y NS1-, y RT-PCR. Se identificó que la sensibilidad, especificidad, valores predictivos y área bajo la curva (AUC) de las PDR fue inferior respecto al estándar (ELISA IgM Positivo o PCR positivo) al igual que las pruebas de ELISA. El análisis basado en la combinación de dos pruebas, aumentó la sensibilidad y especificidad entre 35% hasta el 50%. La inclusión de variables clínicas y hematológicas en un análisis de regresión logística identificó su utilidad en el diagnóstico y la clasificación de los casos (DWoWS, DWS, SD) y febriles no dengue (OFI). Estas variables se consideraron en el diseño de árboles de decisión para determinar el porcentaje de confirmación de casos. El algoritmo que integró la combinación de PDR NS1 OR ELISA IgM con mialgias, dolor abdominal, plaquetas <140.000/mm3 detectó el 90.6% de los casos, mientras la combinación de PDR IgM OR PDR NS1 con variables clínicas y hematológicas, identificó el 81.6%. El primer algoritmo puede ser utilizado en instituciones de salud que cuentan con capacidad para su aplicación en el diagnóstico de rutina; mientras que el segundo, en instituciones de áreas endémicas por la combinación de pruebas accesibles y de bajo costo, que complementan la información clínica y permitiría realizar un diagnóstico y tratamiento oportuno. El segundo componente del trabajo se centró en evaluar algunos biomarcadores, en muestras de individuos con dengue, febriles no dengue, e individuos sin antecedente de infección por DENV. El análisis evaluó la asociación entre los niveles de estas moléculas y la severidad de la enfermedad. Los niveles de los biomarcadores analizados no presentaron elevación significativa al comparar los grupos de diagnóstico y la severidad. Se encontró una asociación moderada entre los niveles de HMGB1 y la edad, y los niveles de tropomiosina con el recuento de leucocitos y plaquetas en el grupo DWoWS. Nuestros hallazgos confirman la complejidad de la búsqueda de biomarcadores para establecer pronóstico, y resaltan la necesidad del estudio simultáneo de biomarcadores en diferentes fases de la enfermedad para identificar su dinámica y asociación con las manifestaciones clínicas. El tercer componente del trabajo evaluó la activación y disfunción del endotelio y el papel que podría desempeñar la proteína HMGB1. La estrategia aplicada incluyó la evaluación de un modelo de células endoteliales polarizadas, expuestas a sobrenadantes de PBMCs infectados por DENV2 (I – Mo), no infectados (NI – Mo) o la proteína HMGB1 recombinante. Para identificar si los cambios en el endotelio fueron producidos por HMGB1 u otros factores, se consideró la evaluación de tres condiciones de neutralización. La primera dirigida contra HMGB1, la segunda la inhibición de los receptores de esta proteína (TLR4 y la combinación RAGE-TLR4), y la tercera la neutralización de tres citocinas (TNF-α, IL-6 e IL-8). Se identificó que las EC expuestas a los sobrenadantes I - Mo liberan HMGB1 entre otras moléculas, indujeron cambios en el endotelio caracterizados por un perfil inflamatorio temprano, sin afectar la viabilidad celular. La inhibición directa e indirecta evidenció que disminución en la TEER, variación en la permeabilidad, aumento en la expresión de mRNA y la expresión y localización de proteínas, son debidos al efecto conjunto de HMGB1 con otras moléculas. Estos hallazgos demuestran que los estímulos I – Mo y rHMGB1 están relacionados con la activación temprana del endotelio, los cambios morfológicos, y la alteración de la continuidad de las células. Podemos concluir que la activación y el daño endotelial son producto de la actividad de HMGB1 como alarmina, lo cual evidencia una cinética diferente durante el curso de la infección. Este efecto conduce a que la búsqueda de biomarcadores se convierta en un panorama complejo de interpretación, que requiere de una exploración de estrategias para la determinación del momento específico en el que presentan las manifestaciones clínicas asociadas a severidad y variaciones en los biomarcadores, conduciendo a la correcta interpretación de estos parámetros, y conduzcan a que la aplicación de algoritmos de diagnóstico tengan un alto desempeño en la detección y confirmación de los casos, demostrando su eficacia en la aplicación en una población específica.
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    Evaluación de la actividad inmunomoduladora in vitro de un aislado clínico de Citomegalovirus humano
    (2023) Bohórquez Ávila, Sonia del Pilar; Castellanos Parra, Jaime Eduardo; Velandia Romero, Myriam Lucía; Bohórquez Ávila, Sonia del Pilar [0000-0002-2113-3959]
    El Citomegalovirus humano (HCMV) continúa siendo uno de los principales causantes de complicaciones en los pacientes trasplantados. A pesar de que existen varios reportes sobre la relación entre determinado(s) genotipo(s), el curso clínico e incluso el deceso del paciente, la identificación del genotipo de HCMV no se hace rutinariamente después de detectar la infección o la reactivación. Adicionalmente se sabe que este virus ejerce una compleja actividad inmunomoduladora, la cual al parecer le permite persistir en latencia en individuos inmunocompetentes, pero que en inmunosuprimidos puede facilitar la reactivación de la infección y la diseminación a diferentes compartimientos anatómicos y tejidos, hecho que puede estar relacionado con la gran variedad de complicaciones asociadas. El estudio in vitro de la actividad inmunomoduladora de HCMV se hace empleando cepas de referencia, con alto número de pasajes en cultivo celular, sin tomar en consideración las alteraciones genómicas producto de la adaptación, que pueden afectar el tropismo, la modulación inmunológica y la latencia, entre otros. Estas cepas se usan por la dificultad de obtener aislados clínicos de HCMV debido al ciclo replicativo lento y la probabilidad de coinfecciones. Es por esto por lo que se planteó evaluar y comparar la actividad inmunomoduladora in vitro de un aislado clínico de HCMV con cepas de referencia, en una línea celular de monocitos humanos. Para ello se plantearon tres estrategias metodológicas. En la primera se evalúo la posible relación entre los genotipos de HCMV con las complicaciones y el desenlace, en pacientes pediátricos receptores de trasplante de precursores hematopoyéticos (RTPH). En segundo lugar, se establecieron las condiciones metodológicas para aislar y cosechar HCMV a partir de muestras clínicas; finalmente, se evaluó y comparó in vitro la activación y expresión de mediadores inflamatorios en una línea celular de monocitos/macrófagos infectados con el aislado clínico, teniendo como referencia el efecto que inducen dos cepas de laboratorio del HCMV. A continuación, se describe la metodología y los resultados obtenidos de cada uno de los objetivos planteados. HCMV se transmite por contacto próximo a través de fluidos corporales como la orina, leche materna y saliva, por lo que la mayoría de los individuos infectados han adquirido el virus en los primeros años de vida y aparece en estos fluidos en las descargas virales asintomáticas. Por otra parte, se han identificado cinco genotipos de HCMV lo que demuestra su variabilidad genética y algunos estudios sugieren una relación entre el genotipo infectante, las coinfecciones (más de un genotipo) y el desenlace, sobre todo en RTPH. Sin embargo, hasta el momento en el país la genotipificación no es un procedimiento rutinario y no se considera a la saliva como una muestra confiable, útil para su rastreo. Para evaluar esto, se obtuvieron 105 muestras de saliva de 20 pacientes pediátricos RTPH recolectadas semanalmente en la Unidad de Trasplante de Precursores Hematopoyéticos de la Fundación Hospital Pediátrico la Misericordia (UT-HOMI). Se confirmó la infección de HCMV por PCR detectando el gen UL83; y por PCR anidada y secuenciación se determinó el genotipo. Se detectó el ADN viral en 29 muestras de 12 pacientes y en todos los casos se confirmó el genotipo gB1, sin coinfecciones. Luego del análisis no se estableció ninguna relación entre la detección de HCMV en saliva, el genotipo identificado, con las complicaciones y el desenlace en el grupo de pacientes que participó en el estudio. Este resultado confirma la alta frecuencia de HCMV en los pacientes, la factibilidad de emplear la saliva para la detección y genotipificación de HCMV y la necesidad de evaluar la relación entre el genotipo(s) identificado(s) con el curso clínico del paciente trasplantado. De otro lado, la obtención de aislados clínicos a partir de fluidos corporales puede resultar difícil, por el tiempo que puede demorar la aparición de efecto citopático (ECP) y porque en los primeros pasajes las partículas virales permanecen asociadas a las células y la concentración es baja en el sobrenadante celular. En nuestro segundo objetivo se propuso aislar el HCMV a partir de muestras de orina, lavado broncoalveolar (LBA) y plasma de pacientes hospitalizados en el HOMI. De 61 niños evaluados, se obtuvieron 6 muestras de orina, 27 de LBA y 37 plasmas. De las 9 muestras positivas por PCR para HCMV, se hicieron diluciones que se inocularon sobre células MRC-5 utilizando la técnica de centrifugación (Shell-vial), luego se retiró el inóculo y se observaron diariamente. De las 5 muestras con ECP se recolectó el sobrenadante, el cual fue inoculado nuevamente en células MRC-5. Sobre estas últimas -con ECP atribuible a HCMV- se recolectó y almacenó a -80°C el lisado celular sonicado y el sobrenadante. En las células inoculadas con plasma el cultivo mostró daño celular temprano que impidió continuar con el aislamiento. Solo a partir de una muestra de LBA -negativa para Virus Herpes Simplex 1 y 2, Adenovirus, Enterovirus y Poliomavirus-, se logró el aislamiento y amplificación de un HCMV genotipo gB1, que denominamos B52, con un título de 2.18 x106 UFP/mL, luego de su segundo pasaje. Estos resultados muestran que la obtención de aislados clínicos a partir de las descargas virales asintomáticas en fluidos como la saliva, LBA y la orina puede ser eficaz y eficiente implementando algunas estrategias técnicas como el Shell vial y lisando las células, lo que mejora los títulos y permite obtener un aislado con muy bajos pasajes en cultivo. Finalmente, luego de la infección primaria, HCMV establece latencia en las células CD34+ y persiste en los monocitos de sangre periférica CD14+. En estas células, el HCMV modula la respuesta inmunológica: i) promoviendo la activación de los monocitos circulantes y su diferenciación a macrófagos tisulares; ii) regulando la secreción de algunas citocinas y iii) reclutando células inmunes; así, genera un ambiente proinflamatorio, al tiempo que regula la respuesta inmune antiviral. Esta actividad es uno de los atributos de HCMV que lo hace altamente patogénico en individuos inmunosuprimidos, como los RTPH. Para el estudio de la actividad inmunomoduladora de HCMV comúnmente se utilizan cepas de laboratorio como Towne y Merlin, en las que por su alto o bajo número de pasajes -respectivamente- se han establecido modificaciones genómicas comprometiendo segmentos importantes que cambian el tropismo y la patogenicidad. Aun así, estas cepas son usadas con frecuencia debido a la dificultad de obtener aislados clínicos. Para evaluar el efecto del aislado clínico B52 en la activación y expresión de mediadores inflamatorios se utilizó la línea celular monocítica THP-1; las células fueron infectadas a una MOI de 1, con el aislado o con las cepas de referencia (Towne o Merlin), aplicando el modelo latencia – reactivación. Como control de diferenciación y activación celular las THP-1 fueron tratadas (+) o no tratadas (-) con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), y evaluadas a las 48, 72 y 120 horas posinfección (hpi). Al cabo de cada uno de los tiempos, se evaluó por citometría de flujo la expresión de marcadores de diferenciación CD14, CD64, CD11b, CD68 y activación celular CD206 y HLA-DR. Por RT-qPCR la expresión relativa de los transcritos para las citocinas asociadas a la activación, diferenciación y movilización de monocitos/macrófagos como IFN e IFNβ; TNF, IL-1β, CXCL-10, IL-8 e IL-10. Finalmente, en el sobrenadante se cuantificó la concentración de algunos de estos y otros mediadores como IFNγ, IL-6, CCL-18, IL-12p70, CXCL-9, IL-4, RANTES, MCP-1, CCL-22, MIP-1β, FAS-L y los factores de crecimiento VEGF-A, PDGF-AB. La expresión de marcadores de superficie de las células infectadas y tratadas con PMA mostró una expresión mayor de los marcadores CD14 y CD11b respecto al control. El efecto del aislado clínico B52 sobre la expresión de CD206 y HLA-DR fue dependiente de la estimulación con PMA y se incrementó con el tiempo. Las cepas de laboratorio Merlin y Towne indujeron una expresión más temprana de estos marcadores con disminución a las 120 hpi. La expresión relativa de los transcritos mostró que B52 moduló diferencialmente en el tiempo la expresión de los interferones y las citocinas proinflamatorias TNFα, CXCL-10, IL-1β e IL-8 y sobrereguló la expresión relativa de IL-10, respecto a las cepas Merlin y Towne. Sobre las concentraciones de citocinas y factores de crecimiento en el sobrenadante se encontró que el efecto de la infección con B52 estuvo por encima del inducido por las cepas de laboratorio en la mayoría de los casos, además de observarse en las primeras 48 horas luego de la infección. El efecto del tratamiento con PMA fue variable y no siempre significó incremento de las concentraciones de los analitos. Finalmente, en la secreción de IL-10 y de FAS-L, se observó un efecto diferencial y temprano con niveles más altos inducido por B52, principalmente en las células PMA (-), en comparación con el efecto de las cepas de laboratorio.