Evaluación del comportamiento de la actividad enzimática de la carbapenemasa KPC en aislamientos de Pseudomonas aeruginosa por medio de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
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2023
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Resumen
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa, no fermentadora de la lactosa, aerobio de tipo facultativo (1). Es bastante persistente en el ambiente, puede llegar a adaptarse de manera eficaz en el agua y en el suelo, viviendo con requerimientos nutricionales mínimos y tolerando diversas condiciones físicas. Es considerada un patógeno oportunista, generando infecciones en los humanos que si no son tratadas a tiempo pueden ser mortales, con resistencia natural a varias familias de antibióticos y una extraordinaria capacidad de generar y adquirir diversos mecanismos de resistencia, entre ellos las carbapenemasas, enzimas con actividad para degradar los antibióticos carbapenémicos (pertenecientes a los β-lactámicos) usados como último recurso frente a la “multirresistencia extrema” de las bacterias. En Colombia fue reportado por primera vez un aislamiento de P. aeruginosa portadora de la enzima KPC (2) (EC 3.5.2.6) (3) una potente carbapenemasa capaz de hidrolizar los carbapenémicos y la mayoría de los antibióticos β-lactámicos. Actualmente, esta enzima es la más frecuente en aislamientos resistentes a los carbapenémicos, lo cual podría sugerir su eficiente capacidad de hidrólisis. Por tal razón, el objetivo de este proyecto es evaluar el comportamiento de la actividad enzimática de KPC en el proceso de hidrólisis de antibióticos carbapenémicos en aislamientos clínicos de Pseudomonas aeruginosa por medio de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Las muestras fueron facilitadas y/o recuperadas de instituciones de salud colombianas, estos aislamientos (24Pae112, 34Pae8, 34Pae23, 34Pae36, 30Pae2) fueron sometidos a pruebas de confirmación de especie y de presencia del gen que codifica para KPC por medio de técnicas moleculares como PCR. Posteriormente, por medio del espectrofotómetro, se evaluó la capacidad de hidrólisis de cada uno de los aislamientos; para esto, se realizaron ensayos de reacción enzimática con 30 µg/mL de MER ™ y 9x10^8 UFC de bacteria total a 37°C y después de 10 minutos de reacción hubo una reducción gradual del sustrato en orden cero, en un rango del 20%-50% con diferencias estadísticas significativas (P<0,05) entre cada uno de los aislamientos. A su vez, se evaluó este comportamiento con extracto proteico en espectrofotómetro y se evidenció que después de 18 minutos de reacción a temperatura ambiente, con 30 µg/mL de MER ™ y 2 mg de proteína, hubo una degradación gradual del sustrato en orden cero, en un rango del 77%-98%. Teniendo en cuenta lo obtenido previamente, y entendiendo que la técnica de cromatografía permite cuantificar a un límite de detección bajo (en el orden de µg), se realizó la medición en el equipo HPLC partiendo de 80 µg/mL de M2574-50mg y 2 mg de proteína, obteniéndose una reducción del 51%-99% del sustrato inicial; en ambos equipos se presentaron diferencias estadísticas significativas (P<0,05) entre cada uno de los aislamientos. De acuerdo con los resultados obtenidos, se concluye que los aislamientos evaluados presentaron una notable capacidad de hidrólisis del sustrato y que los ensayos tanto con bacterias totales como con extracto proteico revelaron reducciones significativas en orden cero, con un rango de reducción que oscila entre el 20% y el 98%, lo que sugiere una eficaz actividad enzimática por parte de KPC. Además, la cuantificación que se llevó a cabo por medio de las dos técnicas empleadas mostró una reducción considerable del sustrato, respaldando aún más la actividad enzimática observada. Estos resultados subrayan la importancia de comprender la actividad de la enzima y tienen implicaciones significativas en el contexto de la resistencia antimicrobiana y la evaluación de nuevos compuestos farmacológicos
Descripción
Abstract
Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, non-lactose-fermenting, facultative aerobic bacteria (1). It is quite persistent in the environment, can adapt effectively in water and soil, living with minimal nutritional requirements and tolerating diverse physical conditions. It is considered an opportunistic pathogen, generating infections in humans that if not treated in time can be fatal, with natural resistance to several families of antibiotics and an extraordinary ability to generate and acquire various resistance mechanisms, including carbapenemases, enzymes with activity to degrade carbapenem antibiotics (belonging to the β-lactams) used as a last resort against the "extreme multi-resistance" of bacteria. In Colombia, an isolate of P. aeruginosa carrying the KPC enzyme (2) (EC 3.5.2.6) (3), a potent carbapenemase capable of hydrolyzing carbapenemics and most β-lactam antibiotics, was reported for the first time. Currently, this enzyme is the most frequent in carbapenem-resistant isolates, which could suggest its efficient hydrolysis capacity. For this reason, the purpose of this project is to evaluate the behavior of the enzymatic activity of KPC in the hydrolysis process of carbapenem antibiotics in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates by high performance liquid chromatography (HPLC).
These isolates (24Pae112, 34Pae8, 34Pae23, 34Pae23, 34Pae36, 30Pae2) were tested for species confirmation and for the presence of the gene coding for KPC by means of molecular techniques such as PCR. Subsequently, by means of the spectrophotometer, the hydrolysis capacity of each of the isolates was evaluated; for this, enzymatic reaction assays were performed with 30 µg/mL of MER ™ and 9x10^8 CFU of total bacteria at 37°C and after 10 minutes of reaction there was a gradual reduction of the substrate in zero order, in a range of 20%-50% with significant statistical differences (P<0.05) between each of the isolates. In turn, this behavior was evaluated with protein extract in spectrophotometer, and it was evidenced that after 18 minutes of reaction at room temperature, with 30 µg/mL of MER ™ and 2 mg of protein, there was a gradual degradation of the substrate in zero order, in a range of 77%-98%. Taking into account what was previously obtained, and understanding that the chromatography technique allows quantification at a low detection limit (in the order of µg), the measurement was performed in the HPLC equipment starting from 80 µg/mL of M2574-50mg and 2 mg of protein, obtaining a reduction of 51%-99% of the initial substrate; in both equipment’s significant statistical differences (P<0.05) were presented between each of the isolates. According to the results obtained, it is concluded that the isolates evaluated presented a remarkable substrate hydrolysis capacity and that the assays with both total bacteria and protein extract revealed significant reductions in zero order, with a reduction range between 20% and 98%, suggesting an efficient enzymatic activity by KPC. In addition, quantification carried out by the two techniques employed showed considerable substrate reduction, further supporting the observed enzymatic activity. These results underscore the importance of understanding enzyme activity and have significant implications in the context of antimicrobial resistance and the evaluation of new pharmacological compounds.
Palabras clave
Pseudomona aeruginosa, KPC, Actividad enzimática, Resistencia antimicrobiana, Antibióticos β-lactámico, Antibióticos carbapenémicos, HPLC
Keywords
Pseudomona aeruginosa, KPC, enzymatic activity, antimicrobial resistance, β-lactam antibiotics, carbapenem antibiotics, HPLC, Pseudomona aeruginosa, KPC, Enzymatic activity, Antimicrobial resistance, β-lactam antibiotics, Carbapenem antibiotics, HPLC