Estandarización de protocolo para la obtención de mastocitos provenientes de pulpa dental humana para su caracterización por citometría de flujo
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2022
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Resumen
La metodología empleada por estudios que han analizado la presencia del mastocito en pulpa ha sido parcial, ya que solo se han enfocado en el marcaje de sus moléculas de superficie en inmunohistoquímica. La citometría de flujo podría ser el método ideal ya que conjuga el uso de marcadores de superficie y funcionales de manera simultánea, para lograr identificar esta célula. Objetivo: Estandarizar un método de obtención de poblaciones de mastocitos provenientes de pulpas dentales humanas para su caracterización por citometría de flujo. Metodología: En este estudio descriptivo de corte transversal se obtuvieron 12 muestras de dientes con pulpitis irreversible asintomática de pacientes sistémicamente sanos entre los 18 y 40 años. Mediante dos métodos, no enzimático y enzimático. Respecto a los métodos enzimáticos restantes, se empleó el mismo protocolo de sección mecánica; se realizaron lavados con PBS 1X y ciclos de centrifugación a 400 gravedades durante 5min, para adición del coctel enzimático para digestión de la muestra: 1) Colagenasa IV y Dispasa I, o 2) Colagenasa IV, Tripsina y EDTA. Se realizó incubación overnight y se detuvo reacción enzimática SFB para conteo celular, ajuste y marcaje con mix de anticuerpos (Anti-tryptase, Anti-Chemase, Anti-CD117), se llevó a refrigeración a una temperatura de 4°C/30 min, se centrifugó y se retiró sobrenadante para resuspensión en 500uL de PBS para lectura en citómetro de flujo. Resultados: El porcentaje de células quimasa positivas fue de un 2,6%, 25% triptasa positivas y 3.7% CD117 positivas en sus gates correspondientes. El porcentaje de células doble positivas para quimasa y triptasa fue del 8,9% de la población y un 2% de doble positivas para CD117 y triptasa. Conclusiones: El protocolo con la solución enzimática 2 es aplicable para la obtención y caracterización del mastocito en pulpa dental humana con rasgos clínicos de inflamación. Esto proporcionará una herramienta para futuros estudios sobre el mastocito, su papel en procesos inflamatorios pulpares y enfoque terapéutico.
Descripción
Abstract
The methodology used by different studies for the characterization of the mast cell has not been completely comprehensive, since they have only focused on the marking of its surface molecules in immunohistochemistry. Flow cytometry could be the ideal method that specifically combines the use of surface and functional markers simultaneously, to identify this cell and thus establish an ideal method by which the mast cell can be characterized. Objetive: To standardize a method for obtaining populations of mast cells from human dental pulps for their characterization by flow cytometry with medimachine and enzymatic protocols. Methods: 12 samples of teeth with a diagnosis of asymptomatic irreversible pulpitis were obtained from systemically healthy patients between 18 and 40 years of age. Three sample processing methods were used, the non-enzymatic method and the enzymatic methods, the same mechanical section protocol; washes were carried out with PBS 1X and centrifugation cycles at 400 gravities for 5 min, for subsequent addition of the enzymatic cocktail for sample digestion: 1) Collagenase type IV and Dispase I, or 2) Collagenase type IV, Trypsin and EDTA. Overnight incubation was performed and the enzymatic reaction was stopped with FBS for subsequent cell counting, adjustment and labeling with a mix of antibodies (Anti-tryptase, Anti-Chemase, Anti-CD117), it was refrigerated at a temperature of 4°C/30 min, it was centrifuged and the supernatant was removed for resuspension in 500uL of PBS for reading in a flow cytometer. Results: In dental pulp, the percentage of chymase positive cells was 2.6%, tryptase positive 25% and CD117 positive 3.7% in their corresponding gates. In addition to this, the percentage of double positive cells for chymase and tryptase was 8.9% of the population and 2% double positive for CD117 and tryptase. Conclusions: The protocol with enzymatic solution 2 used is applicable for obtaining and characterizing mast cells in human dental pulp with clinical signs of inflammation. This will provide an important tool for future studies on the mast cell, its role in pulpal inflammatory processes and its possible therapeutic approach for this type of pathology.
Palabras clave
Mastocitos, Quimasas, Triptasas, Proteínas Proto-Oncogénicas c-kit, Antígenos CD117
Keywords
Mast cells, Chymases, Tryptases, CD117, FceR1, Proto-Oncogene Proteins c-kit