Expresión del extremo 5´ del gen E1 del virus chikungunya en escherichia coli

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2017

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Resumen

El virus Chikungunya (CHIKV) es un alfavirus de la familia Togaviridae, agente causante de la fiebre del Chikungunya, enfermedad que ha afectado a más de un millón de personas en el continente americano en los últimos tres años. Aunque la enfermedad causada por el virus no se considera como grave y rara vez es fatal; si es incapacitante y puede comprometer diversos órganos. Además, en cada brote epidémico se describen nuevas y más severas manifestaciones a largo plazo; la artralgia prolongada por meses e incluso años, es una de las complicaciones reportadas con mayor frecuencia. Dado que la introducción de CHIKV en Colombia es reciente (2014), los virus causantes de ese primer brote epidémico aún no han sido caracterizados y que la investigación en el país muy escasa, el laboratorio de Virología de la Universidad El Bosque ha abordado el estudio de la patogénesis y caracterización del virus CHIKV circulante en el país, para lo cual se requiere de la generación de herramientas celulares (modelo de infección in vitro); moleculares (proteínas recombinantes) e inmunológicas (anticuerpos específicos contra proteínas virales). El objetivo principal de este trabajo es expresar el extremo 5´del gen E1 con el fin de generar un inmunógeno para la obtención de anticuerpos policlonales que permitan detectar la infección por CHIKV in vitro. Esta detección se pretende principalmente en células involucradas en la patogénesis de la enfermedad como macrófagos derivados de monocitos y células musculares. Para ello, el fragmento correspondiente al extremo 5´del gen E1 que se encuentra en la región comprendida entre el nucleótido 3 y el 603 del gen E1, se amplificó por PCR a partir de ADN complementario y oligonucleótidos específicos. Después de la purificación del fragmento correspondiente al extremo 5´del gen E1, se insertó en el vector de expresión PinPoint™Xa-2 el cual fue utilizado para transformar bacterias de la cepa TOP10 y obtener un clon. El plásmido recombinante PinPoint™Xa-2-E1 fue propagado y utilizado para transformar tres cepas de Escherichia coli: BL21® y sus derivadas CodonPlus RIL® y RosettaTM. En clones de cada una de estas tres cepas, anteriormente obtenidas se indujo la expresión de la proteína E1 y se observó que la proteína de fusión o E1 biotinilada de 38 kDa sólo se sintetizó en la cepa Rosetta™. Ensayos de solubilidad de la proteína E1 producida por esta cepa, permitieron establecer que la proteína recombinante es insoluble en condiciones nativas pero puede ser solubilizada en presencia de concentraciones bajas de SDS (0.25%). Por último, se realizó un ensayo preliminar de purificación por cromatografía de afinidad con una resina de avidina; la presencia de la proteína en la fracción de proteínas no unidas y en los lavados mostró que la proteína no fue retenida por el ligando de afinidad. Aunque se logró la expresión del fragmento de 600 pb del gen E1 correspondiente al extremo 5´en una cepa de E.coli, es necesario modificar algunas condiciones en la cromatografía de afinidad y/o explorar otras estrategias de purificación que conduzcan a la obtención de una fracción enriquecida o parcialmente pura de la proteína recombinante.

Descripción

Abstract

Chikungunya virus (CHIKV) is an alfavirus of the family Togaviridae, causative agent of the Chikungunya fever, disease that has affected more than one million persons in the American continent in the last three years. The disease caused by this virus is not considered serious and rarely is it fatal; it can cause incapacity and can compromise diverse organs. In addition, with every epidemic outbreak they are described new and more severe manifestations and, long-term complications, being the arthralgia prolonged per months and enclosed years, the complication brought with major frequency. Although CHIKV’s introduction in Colombia is recent, the causative virus first epidemic outbreak have not been characterized and the investigation in Colombia still very scanty, the laboratory of Virology has approached the study of the pathogenesis and characterization of the circulating virus in the country, for which needs the generation of cellular (model of in vitro infection); molecular (proteins recombinants) and immunological (specific antibodies against viral proteins) tools. The principal objective of this work was to express the end 5' gene of E1 in order to have an immunogenic cell for the generation of specific polyclonal antibodies that allow the detection of the infection in vitro of CHIKV, principally in cells involved in the pathogenesis of the disease as derivative macrophages of monocytes and muscular cells. For it, the fragment of 600 pb correspondent to the region understood between the nucleotide 3 and 603 of the gene, was amplified by PCR from complementary DNA and specific primers; After being purified it was inserted in the vector of expression PinPoinTXa-2 which was used to transform bacteria of the vine-stock Top10 and to obtain a clone. The recombinant plasmid PinPointXa™2-E1 was spread and used to transform three strains of Escherichia coli: BL21 and his derivatives Codon Plus RIL and RosettaTM. The clones of each one of these three strains was induced to express the gene and we observed a biotiniladed protein of 38 KDa only sintetized in Rosetta strain. Tests of solubility establish that the recombinant protein was insoluble in its native conditions but can be solubilized in presence of SDS's low concentrations (0.25 %). Finally, a preliminary test purification was realized by affinity chromatography by a resin of avidine; the presence of the protein in the fraction of not close proteins and in the washes, indicated that the protein was not retained for going well together of affinity, so to express the fragment of the gene E1 corresponding to the end 5'en E.coli's strain, was necessary to modify some conditions in the affinity chromatography and / or to explore other strategies of purification that lead the purification of the recombinant protein.

Palabras clave

Chikungunya, Proteína E1, Proteínas recombinantes, Clonación, Escherichia coli

Keywords

Chikungunya, Recombinant proteins, Protein E1, Cloning, BL21 strain

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