Evaluación del potencial antiviral del Bortezomib contra el virus Chikungunya
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2021
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Resumen
El sistema ubiquitina-proteasoma (Ub-P) es responsable de la degradación específica de proteínas. Ha sido ampliamente descrito que la proteólisis dependiente del sistema Ub-P es fundamental para la replicación de virus patogénicos humanos y que el Bortezomib es un inhibidor del proteasoma aprobado por la FDA para el tratamiento de mieloma múltiple, este trabajo evaluó su efecto sobre la replicación del virus chikungunya (CHIKV) en células HEK293T. Se determinó la concentración y el tiempo de exposición al Bortezomib para inhibir el proteasoma y no afectar la viabilidad celular. Las células se trataron con concentraciones desde 50 hasta 2500nM por periodos de 2h hasta 24h y se evaluó la viabilidad celular por el ensayo de resazurina. Para verificar la inhibición del proteasoma se realizó un ensayo de actividad proteolítica, a partir de extractos proteicos de células tratadas y no tratadas con Bortezomib y un substrato fluorogénico (SLLVY-AMC) para medir la actividad similar a quimotripsina del proteasoma. Luego, se llevó a cabo la infección con CHIKV a moi 1 en presencia del inhibidor y 24h después se recolectaron los sobrenadantes para cuantificar las partículas virales liberadas por RT-qPCR. El tratamiento por 4h con 1,0 μM de Bortezomib fue suficiente para reducir la actividad del proteasoma en un 30% sin afectar la viabilidad celular. Bajo estas condiciones, el inhibidor ocasionó una disminución de 2 unidades logarítmicas en el título viral. El Bortezomib podría ejercer un efecto antiviral sobre el virus chikungunya, aunque es necesario comprobar este efecto utilizando otras líneas celulares humanas.
Descripción
Abstract
The ubiquitin-proteasome system (Ub-P) is responsible for specific protein degradation. Given that proteolysis mediated by the (Ub-P) has been previously documented as a fundamental factor in the replication cycle of pathogenic viruses to humans, and that Bortezomib is a known proteasome inhibitor approved by the FDA for the treatment of multiple myeloma, this investigation has evaluated it's function in the replication cycle of Chikungunya virus (CHIKV) in HEK293T cells. First we determined the adequate concentration and time of exposure to Bortezominb so the cellular viability would not be affected. Cells were treated with variable concentrations of Bortezomib from 50 nM to 2500 nM and we observed times of exposure from 2 hours to 24 hours. To determine the cellular viability a resazurin assay was performed. To determine the proteasome activity, a proteolytic assay was performed using the extract taken from the cells previously treated with Bortezomib adding a fluorogenic substrate (SLLVY-AMC) so the chymotrypsin-like activity of the proteasome could be measured. The infection with CHIKV was done at a moi of 1 in the presence of the proteasome inhibitor. At 24h post-infection, the cell supernatants were collected and the viral particles were quantified using a RT-qPCR. It was determined that the treatment with Bortezomib for 4 hours at a concentration of 1,0 μM was enough to reduce the proteasome activity by 30% without affecting cell viability. Under these conditions, the inhibitor was able to lower viral titles by 2 logarithmic units. Therefore, Bortezomib could have an antiviral effect over Chikungunya virus, but this effect has to be confirmed using other human cell-lines.
Palabras clave
Virus chikungunya, Bortezomib, Proteasoma, Inhibición, Replicación
Keywords
Chikungunya virus, Bortezomib, Proteasome, Inhibition, Replication