Comparación sistemática de estrategias para lograr la expresión soluble de proteínas recombinantes de plasmodium falciparum en E. coli
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Publicado en
Molecular Biotechnology, 1559-0305, Vol.60, Nro.12, 2018 p. 887-900
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Springer
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Resumen
Se utilizaron construcciones que contenían secuencias codificantes parciales de miosina A, miosina B y proteína asociada a glideosoma (50 kDa) de Plasmodium falciparum para desafiar varias estrategias diseñadas para mejorar la producción y solubilidad de proteínas recombinantes en Escherichia coli. Los ensayos se llevaron a cabo induciendo la expresión en un cultivo en fase logarítmica tardía, optimizando la concentración del inductor, reduciendo la temperatura de crecimiento de los cultivos inducidos y complementando los aditivos en el tampón de lisis. Además, las proteínas recombinantes se expresaron como proteínas de fusión con tres etiquetas diferentes (6His, GST y MBP) en cuatro cepas de E. coli diferentes. Descubrimos que la única condición que producía proteínas solubles consistentemente era el uso de MBP como etiqueta de fusión, que se convirtió en una herramienta valiosa para detectar las proteínas utilizadas en este estudio y no causó ninguna interferencia en los ensayos de interacción proteína-proteína (Far Western Blot). Además, encontramos que la cepa BL21-pG-KJE8 no mejoró la solubilidad de ninguna de las proteínas recombinantes producidas, mientras que la cepa BL21-CodonPlus (DE3) -RIL mejoró la expresión de algunas de ellas independientemente del contenido de codones raros. Las proteínas con codones raros que se encuentran en frecuencias altas (> 10%) se expresaron de manera eficiente en cepas que no complementan los ARNt de estos tripletes. mientras que la cepa BL21-CodonPlus (DE3) -RIL mejoró la expresión de algunos de ellos independientemente del contenido de codones raros. Las proteínas con codones raros que se encuentran en frecuencias altas (> 10%) se expresaron de manera eficiente en cepas que no complementan los ARNt de estos tripletes. mientras que la cepa BL21-CodonPlus (DE3) -RIL mejoró la expresión de algunos de ellos independientemente del contenido de codones raros. Las proteínas con codones raros que se encuentran en frecuencias altas (> 10%) se expresaron de manera eficiente en cepas que no complementan los ARNt de estos tripletes.
Descripción
Abstract
Constructs containing partial coding sequences of myosin A, myosin B, and glideosome-associated protein (50 kDa) of Plasmodium falciparum were used to challenge several strategies designed in order to improve the production and solubility of recombinant proteins in Escherichia coli. Assays were carried out inducing expression in a late log phase culture, optimizing the inductor concentration, reducing the growth temperature for induced cultures, and supplementing additives in the lysis buffer. In addition, recombinant proteins were expressed as fusion proteins with three different tags (6His, GST, and MBP) in four different E. coli strains. We found that the only condition that consistently produced soluble proteins was the use of MBP as a fusion tag, which became a valuable tool for detecting the proteins used in this study and did not caused any interference in protein-protein interaction assays (Far Western Blot). Besides, we found that BL21-pG-KJE8 strain did not improve the solubility of any of the recombinant protein produced, while the BL21-CodonPlus(DE3)-RIL strain improved the expression of some of them independent of the rare codon content. Proteins with rare codons occurring at high frequencies (» 10%) were expressed efficiently in strains that do not supplement tRNAs for these triplets.
Palabras clave
Etiqueta GST, Etiqueta MBP, Plasmodium falciparum, Producción de proteínas recombinantes, Expresión soluble
Keywords
6His-tag, Escherichia coli, GST-tag, MBP-tag, Plasmodium falciparum