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Desarrollo de un hidrogel como soporte para el cultivo de células osteoprogenitoras
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Resumen
En la actualidad anualmente, hay alrededor de 4’000.000 de cirugías relacionadas con sustitutos de injerto óseo a nivel mundial (Brydone et al, 2010). Los implantes usados como soporte en dichas cirugías para la reparación de traumatismos o fracturas de gran tamaño tienen un elevado costo, esta problemática revela la necesidad de fabricar nuevos biomateriales de bajo costo que puedan ser usados como matrices para el cultivo de células madre autólogas, y que favorezcan la integración del implante. Se ha considerado el uso de polímeros o de materiales compuestos para el desarrollo de matrices con propiedades osteoconductivas que estimulen la proliferación de células osteogénicas cultivadas previamente a la implantación.
El polivinil alcohol (PVA) es un polímero del cual pueden obtenerse hidrogeles por procedimientos relativamente económicos, con características físico-químicas que dependen de la concentración y del método de preparación. Los hidrogeles de PVA se caracterizan por no ser citotóxicos, ni genotóxicos y por tener una alta integridad mecánica ((1) Hassan et al., 2000). Pueden mezclarse con materiales cerámicos, tales como la apatita carbonatada (CAp) y con proteínas como el colágeno que favorecen la adhesión celular y la expresión de marcadores característicos de la línea de diferenciación osteoblástica, lo que demostraría una mayor funcionalidad por parte de estos soportes compuestos. Teniendo en cuenta las características de este polímero, se planteó optimizar la síntesis un hidrogel compuesto por Polivinil alcohol-Colágeno tipo I- Apatita Carbonatada (PVACol I-CAp) como un soporte de matriz tridimensional con propiedades osteoconductivas y osteoinductivas. En el hidrogel se evaluó el crecimiento y la expresión de algunos marcadores de diferenciación osteoblástica de células aisladas de médula ósea de porcinos.
Para cumplir este objetivo, se estandarizó la síntesis de hidrogeles de PVA-Col I-CAp, en una proporción 6%(v/v) PVA de alto peso molecular, 94%(v/v) PVA de bajo peso molecular, 0,8% Colágeno tipo I y 0,6% Apatita carbonatada. Para esto se utilizó CAp preparada de acuerdo al protocolo descrito por Zakaria et al., 2009 y se realizó la extracción de colágeno tipo I en el laboratorio a partir de piel de feto de bovino por medio de la modificación del protocolo propuesto por Gross et al., 1955. Sobre el hidrogel propuesto y para evaluar su comportamiento como soporte, se realizó el cultivo primario de células osteoprogenitoras de médula ósea de porcino según el protocolo descrito por Mikan et al., 2009. Posterior a la siembra de células, se compararon los fenotipos, la proliferación celular y se analizó la expresión de marcadores transcripcionales asociados con el compromiso de células a linaje osteoblástico por RT-PCR. Paralelamente, se comparó funcionalmente la actividad fosfatasa alcalina y la formación de matriz mineralizada por las células sembradas en distintos tiempos de experimentación. Esta investigación concluyo con la obtención de un hidrogel osteoconductivo, osteoinductivo, apto para la estimulación de células a la diferenciación ósea.
Esta investigación permitió desarrollar una matriz tridimensional para el estudio de la diferenciación osteoblástica y contribuyó a la descripción de un modelo de diferenciación in vitro en una matriz. Además, se espera incentivar el desarrollo tecnológico de materiales fabricados en nuestro país, que fortalezcan el conocimiento y desarrollo en el área de biomateriales.
Descripción
Abstract
Today annually, there are about 4'000.000 surgeries related to bone graft substitutes around the world (Brydone et al, 2010). The implants that are used like support in those surgeries for trauma or large fractures repair have high cost, that problematic reveal the need to manufacture new biomaterials to reduce the cost which can be used as culture scaffolds of autologous stem cells and promoting the integration of the implant. We have considered the use of polymers or composite materials for the development of scaffolds with osteoconductive properties that stimulate proliferation of osteogenic cultured cells prior to implantation.
The polyvinyl alcohol (PVA) is a polymer from which hydrogels can be obtained for relatively economical methods, with physic-chemical characteristics that depend on both concentration and method of preparation. PVA hydrogels are characterized by not being cytotoxic nor genotoxic and having a high mechanical integrity ((1) Hassan et al., 2000). They can be mixed with ceramic materials, such as carbonated apatite (CAp), and proteins as the collagen that promote cell attachment and expression of molecular markers that are characteristic of the osteoblastic differentiation line, this would demonstrate that these compound materials are more functional. Due to the feature of the polymer, it was propose to synthesize polyvinyl alcohol hydrogel –Type I Collagen - Carbonated apatite (PVA- Col I- CAp) as a three-dimensional matrix scaffold with osteoconductive and osteoinductive properties. Growth and the expression of some osteoblast differentiation markers was assessed in bone marrow cells isolated from pigs and cultured on the hydrogel.
To get this goal, a protocol for the synthesis of PVA -Col I- CAp hydrogels were evaluated and standardized in the laboratory, on a proportion 6%(v/v) High molecular weight PVA, 94%(v/v) Low molecular weight PVA, 0,8% Collagen y 0,6% Carbonated Apatite. For this procedure were used CAp prepared according to the protocol described by Zakaria et al., 2009 and laboratory extracted type I collagen from bovine fetus skin through the modification of the Gross et al., 1955 protocol. Above the propose hydrogel and for the evaluation of its behavior as a tissue support its been made a culture of porcine bone marrow osteoprogenitor cells was used according to the protocol described by Mikan et al., 2009. After cell seeding, the phenotypes are compared, cell proliferation and expression of transcriptional markers by RT -PCR were associated with the commitment of osteoblastic lineage cells were analyzed. Simultaneously, the alkaline phosphatase activity and mineralized matrix formation were compared in the cells cultured on different experimental days. This investigation conclude with the production of a hydrogel osteoconductive, osteoinductive and suitable for osteogenic differentiation stimulation.
This investigation let to develop a three-dimensional matrix for studying osteoblast differentiation and contributed to the description of a model of in vitro differentiation in a matrix. Also, is expected to encourage the technological development of manufactured materials in our country, to strengthen the knowledge and development in the area of biomaterials.
Palabras clave
Osteoblastos, Hidrogel, Colágeno, Biomaterial, Apatita carbonatada, Polivinil alcohol
Keywords
Osteoblast, Hydrogel, Collagen, Biomaterial, Carbonated apatite, Polyvinyl alcohol
Temáticas
Procedimientos quirúrgicos
Materiales biocompatibles
Huesos -- Protección
Materiales biocompatibles
Huesos -- Protección