Inducción de la diferenciación de células madre mesenquimales y pre-osteoblastos cultivados con medio condicionado In vitro
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2023
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Resumen
Antecedentes: Las células madre mesenquimales (MSCs) se han venido investigando en regeneración tisular, con la intención de desarrollar nuevas alternativas terapéuticas en diferentes patologías que requieran regeneración o neoformación ósea, como en labio y paladar hendido (LPH). La incidencia mundial de LPH ha aumentado en los últimos años, siendo los injertos óseos los tratamientos más comunes a pesar de sus complicaciones. La ingeniería de tejidos viene desarrollando alternativas a la colocación directa de MSC, analizando moléculas bioactivas secretadas por las células (secretoma) como inductores de diferenciación celular; sin embargo, no hay claridad sobre cuál secretoma es más efectivo. Objetivo: Comparar el efecto sobre la diferenciación de células mesenquimales de pulpa (hDPSCs) y pre-osteoblastos (Saos-2), al ser cultivados con medio condicionado (secretoma). Métodos: Previa aprobación del comité institucional de ética y firma de consentimiento informado, se cultivaron y caracterizaron hDPSC de terceros molares con extracción indicada y células Saos-2 (ATCC HTB-85™). Las hDPSCs se trataron con secretoma de Saos-2 (hDPSCs/Saos-2) y las Saos-2 con secretoma de hDPSCs (Saos-2/hDPSCs). Se evaluaron cambios fenotípicos con microscopio invertido, la tasa de proliferación celular mediante ensayo de resazurina, formación de nódulos de calcio mediante rojo de alizarina, y cambios en expresión de RUNX2 y Osteocalcina (OCN) mediante RT-qPCR. Los experimentos se realizaron por triplicado. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA, Kruskall-Wallis y Scheffé. Resultados: Saos-2/hDPSCs a partir de los 8 días de tratamiento se observaron más largadas y fibroblastoides comparadas con el control, similares a las tratadas con medio de diferenciación osteogénica (MD). hDPSCs/Saos-2 aumentaron sus prolongaciones celulares, su tamaño y su aspecto fibroblastoide; estos cambios fueron más evidentes que en las tratadas con MD. hDPSCs/Saos-2 y MD redujeron la proliferación celular a partir del día 10 de tratamiento, con relación al control (p<0.05). Saos-2/hDPSCs incrementaron la proliferación del sexto al octavo día de tratamiento, posteriormente se redujo el número de Saos-2/hDPSCs y MD, en comparación con control (p<0.05). Se evidenciaron nódulos de mineralización en todos los grupos experimentales y la mayor absorbancia del colorante se evidenció en hDPSCs/Saos-2, Saos-2/hDPSCs y MD a los 21 días de tratamiento, siendo mayor el valor encontrado en Saos-2/hDPSCs comparada con las hDPSCs/Saos-2 (p>0.05). Al evaluar genes de diferenciación celular se encontró que el gen RUNX2 incrementó su expresión significativamente en el grupo de células DPSC tratadas con MD durante 7 días. Después de 21 días se observó un incremento de la expresión de este gen en las células Saos-2/DPSC y en las tratadas con MD. La expresión de OCN también se vio aumentada en las células DPSC y Saos-2 tratadas con MD y en las células Saos-2/ DPSC durante 7 y 21 días. Conclusión: El secretoma de DPSC y de Saos-2 indujo cambios morfológicos, reducción en la proliferación y formación de nódulos de calcificación que sugieren la inducción de diferenciación hacia un fenotipo osteoblástico. Sin embargo, la expresión de marcadores de diferenciación ósea como OCN y RUNX2 solo se incrementaron en las células tratadas con MD y en las células Saos-2/DPSC.
Descripción
Abstract
Background: Mesenchymal stem cells (MSCs) have been investigated in tissue regeneration to develop new therapeutic alternatives in different pathologies requiring bone regeneration or neoformation, such as cleft lip and palate (LPH). The worldwide incidence of LPH has increased in recent years, with bone grafting being the most common treatment despite its complications. Tissue engineering has been developing alternatives to direct MSC placement, analyzing bioactive molecules secreted by the cells (secretome) as inducers of cell differentiation; however, it is unclear which secretome is more effective. Aim: To compare the effect on the differentiation of pulp mesenchymal cells (hDPSCs) and pre-osteoblasts (Saos-2) when cultured with a conditioned medium (secretome). Methods: Upon approval of the institutional ethics committee and informed consent signature, hDPSCs from third molars with indicated extraction and Saos-2 cells (ATCC HTB-85™) were cultured and characterized. The hDPSCs were treated with Saos-2 secretome (hDPSCs/Saos-2) and Saos-2 with hDPSCs secretome (Saos-2/hDPSCs). Phenotypic changes were evaluated by inverted microscopy, cell proliferation rate by resazurin assay, calcium nodule formation by alizarin red, and changes in RUNX2 and Osteocalcin (OCN) expression by RT-qPCR. Experiments were performed in triplicate. ANOVA, Kruskall-Wallis, and Scheffé performed the statistical analysis. Results: Saos-2/hDPSCs from 8 days of treatment were observed to be longer and fibroblastoid compared to control, similar to those treated with osteogenic differentiation medium (MD). hDPSCs/Saos-2 increased their cell prolongations, size, and fibroblastoid appearance; these changes were more evident than those treated with MD. hDPSCs/Saos-2 and MD reduced cell proliferation from day 10 of treatment, compared to the control (p<0.05). Saos-2/hDPSCs increased proliferation from day 6 to 8 of treatment; after that, the number of Saos-2/hDPSCs and MD was reduced compared to the control (p<0.05). Mineralization nodules were evidenced in all experimental groups, and the highest absorbance of the dye was evidenced in hDPSCs/Saos-2, Saos-2/hDPSCs, and MD at 21 days of treatment, being higher values found in Saos-2/hDPSCs compared to hDPSCs/Saos-2 (p>0.05). When cell differentiation genes were evaluated, it was found that the RUNX2 gene increased its expression significantly in the group of DPSC cells treated with MD for seven days. After 21 days, increased expression of this gene was observed in Saos-2/DPSC and MD-treated cells. OCN expression was also upregulated in MD-treated DPSC and Saos-2 cells and Saos-2/ DPSC cells for 7 and 21 days. Conclusion: DPSC and Saos-2 secretome induced morphological changes, reduced proliferation, and calcification nodule formation, suggesting induction of differentiation towards an osteoblastic phenotype. However, the expression of bone differentiation markers such as OCN and RUNX2 was only increased in MD-treated cells and Saos-2/DPSC cells.
Palabras clave
Células madre, Medio condicionado, Diferenciación celular, Cultivo celular, Secretoma
Keywords
Stem cells, Conditioned medium, Cell differentiation, Cell culture, Secretomes