Implementación de un protocolo para la detección de virus dengue por RT-qPCR en muestras biológicas
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Fecha
2022
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Resumen
El dengue es una enfermedad tropical causada por un virus perteneciente a la familia Flaviviridae, es transmitido principalmente por artrópodos hematófagos especialmente por la picadura de mosquitos hembra de la especie Aedes aegypti; este virus presenta cuatro serotipos que causan desde una enfermedad asintomática, síntomas similares a una gripe, hasta hemorragias, falla sistémica y muerte. En Colombia, el principal método de detección molecular del virus en muestras biológicas es la PCR convencional o semianidada; dado que el país en la actualidad tiene una mayor capacidad en infraestructura y personal calificado para realizar pruebas de PCR cuantitativa o en tiempo real (qPCR) en este estudio se evaluó el desempeño de tres protocolos reportados de RT-qPCR en la literatura. Uno tiene como blanco de detección el gen de cápside, otro el extremo 3´no traducible y el tercero un fragmento específico de cada serotipo. Una vez estandarizadas las condiciones de amplificación para cada protocolo, se estableció la eficiencia de la reacción y la sensibilidad analítica de cada ensayo. Los resultados demostraron que el protocolo multiplex, que permite la serotipificación, es el que presenta mayor sensibilidad y por tanto fue utilizado para la detección del virus en muestras provenientes de donantes de sangre y mosquitos Ae. aegypti recolectados en campo. La comparación de los resultados obtenidos con RT-qPCR contra el método tradicional de RT-PCR anidada, nos permite sugerir que este último permite identificar muestras con cargas virales más bajas, por lo cual sería el indicado para definir infección infección por virus dengue.
Descripción
Abstract
Dengue is a tropical disease caused by the dengue virus belonging to the Flaviviridae family. It is transmitted mainly by hematophagous arthropods, especially by the bite of female mosquitoes of the Aedes aegypti species. The four serotypes cause since asymptomatic disease, flu-like symptoms, to hemorrhages, systemic failure, and death. In Colombia, the main method of molecular detection of the virus in biological samples is conventional or semi-nested PCR; given that the country currently has a greater capacity in infrastructure and qualified personnel to perform quantitative or real-time PCR (qPCR) tests, this study evaluated the performance of three reported RT-qPCR protocols.
In the first one, the target is the capsid gene; in the second one, the 3' non-translated end and in the third a specific fragment for each serotype. Once the amplification conditions for each protocol were standardized, the reaction efficiency and analytical sensitivity were established. The results showed that the multiplex protocol, which allows serotyping, is the one with the greatest sensitivity and was therefore used for viral detection in samples from blood donors and mosquitoes collected in the field. The comparison between RT-qPCR results and nested RT-PCR results showed that the latter identify samples with lower viral loads, so it would be indicated to define infection by dengue virus.
Palabras clave
Dengue, Serotipo, RT-qPCR, Detección
Keywords
Dengue, Serotype, RT-qPCR, Detection