Evaluación del metabolismo de la resazurina en función de la forma y tamaño de esferoides tumorales orales
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2021-06
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Resumen
Antecedentes: El cáncer oral es el crecimiento celular maligno localizado en la cavidad oral. El manejo terapéutico y/o quirúrgico de la enfermedad es muy agresivo y se basa en el estadio, localización y tamaño del carcinoma al momento del diagnóstico. Estudios recientes se han enfocado en la búsqueda de nuevas alternativas de tratamiento menos invasivas, menos costosas y con menores efectos adversos. Los ensayos basados en células han sido un pilar importante en estos estudios debido a que son modelos de fácil acceso y de menor costo si se compara con los modelos in vivo. Los cultivos 3D representan una organización espacial y un comportamiento celular muy similar al tumor, aunque se han evidenciado algunas limitaciones para usarlos de rutina en el laboratorio. El ensayo de reducción de resazurina (RR) o alamarBlue® se emplea como una medida indirecta para evaluar el número de células viables en un esferoide, sin embargo, debido a la variabilidad en tamaño, forma y actividad metabólica se han observado modificaciones en el metabolismo de la resazurina, que pueden dar lugar a una mala interpretación de los resultados del ensayo. Objetivo: Evaluar el metabolismo de la resazurina en función de la forma y tamaño de los esferoides de células CAL27. Materiales y Métodos: Se propagaron células CAL27 en frascos de cultivo T75 hasta llegar a una confluencia del 90%, las células se separaron del soporte, se centrifugaron a 1500 rpm y el pellet obtenido se utilizó para la conformación de los esferoides en doce diferentes densidades celulares, después de 72h de incubación se realizó el ensayo RR reemplazando 100 μl de medio por 100μl de una solución de resazurina (80 μM). Para garantizar la transformación de la resazurina a resofurina, los esferoides fueron incubados por 12 h. Los experimentos se realizaron en duplicado usando seis réplicas por cada densidad. Resultados: IMF emitida por los esferoides aumenta a medida que hay un aumento en el tamaño y área de los esferoides, así mismo se evidencio que en tamaños superiores a 300 μm algunos esferoides presentaban una forma irregular. Una agrupación descriptiva de cultivos esféricos y no esféricos dejó ver un aumento poco significativo en la IMF emitida por el grupo esférico. Como se esperaba, en los cultivos 2D se evidenció una mayor tasa del metabolismo de la resazurina con respecto a los cultivos 3D. Conclusiones: Con este trabajo se establecieron valores de referencia de IMF para esferoides de diferentes tamaños. Se demostró que el metabolismo de la resazurina en los esferoides de CAL27 exhibe una relación directamente proporcional al tamaño y densidad celular, sugiriendo que si un tratamiento afecta el tamaño de un esferoide se debería observar una disminución en la reducción de la resazurina.
Descripción
Abstract
Background information: Oral cancer is the malignant cell growth type of cancer found in the oral cavity. The disease's therapeutic and/or surgical management is aggressive, and is determined by the stage, location, and size of the carcinoma at the time of diagnosis. Recent research has focused on finding new treatment options that are less intrusive, less expensive, and have less side effects. Cell-based assays have been a hallmark in this research since they are more accessible and cheaper than in vivo models. Although several limitations have been demonstrated for their normal usage in the laboratory, 3D cultures show a spatial structure and cellular behavior that is remarkably comparable to that of a tumor. The resazurin reduction test (RR) or alamarBlue® is used as an indirect measure to determine the amount of viable cells in a spheroid; nevertheless, alterations in metabolism have been reported due to the fluctuation in size, shape, and resazurin, metabolic activity which can cause test findings to be misinterpreted. Objective: Based on the shape and size of CAL27 cell spheroids, assess resazurin metabolism. Materials and Methods: After 72 hours of incubation, the RR test was performed by replacing 100 l of medium with 100 l of a resazurin solution (80 M) in T75 culture flasks until the cells reached 90% confluence, the cells were separated from the support, centrifuged at 1500 rpm, and the pellet obtained was used for the conformation of the spheroids in twelve different cell densities. The spheroids were incubated for 12 hours to ensure that resazurin was converted to resofurin. The studies were done in pairs, with six replicates for each density. Outcomes: The amount of IMF released by spheroids grows as their size and area grow larger; it was also discovered that some spheroids with diameters more than 300 m had an uneven shape. The MFI radiated by the spherical group was slightly higher than that of the non-spherical group, according to a descriptive grouping of spherical and non-spherical cultures. When compared to 3D cultures, 2D cultures demonstrated a greater rate of resazurin metabolism. Conclusions: MFI reference values for spheroids of various sizes were established with this work. Resazurin metabolism was found to be directly proportional to cell size and density in CAL27 spheroids, implying that if a treatment impacts the size of a spheroid, a drop in resazurin reduction should be detected.
Palabras clave
Cáncer oral, Ensayo de reducción de resazurina, Carcinoma escamo celular, Cultivo celular esferoide, Viabilidad celular
Keywords
Oral cancer, Resazurin reduction assay, Squamous cell carcinoma, Spheroid cell culture, Cell viability