Doctorado en Ciencias Biomédicas

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https://hdl.handle.net/20.500.12495/159

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Examinando Doctorado en Ciencias Biomédicas por Materia "Cytomegalovirus"

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    Evaluación de la actividad inmunomoduladora in vitro de un aislado clínico de Citomegalovirus humano
    (2023) Bohórquez Ávila, Sonia del Pilar; Castellanos Parra, Jaime Eduardo; Velandia Romero, Myriam Lucía; Bohórquez Ávila, Sonia del Pilar [0000-0002-2113-3959]
    El Citomegalovirus humano (HCMV) continúa siendo uno de los principales causantes de complicaciones en los pacientes trasplantados. A pesar de que existen varios reportes sobre la relación entre determinado(s) genotipo(s), el curso clínico e incluso el deceso del paciente, la identificación del genotipo de HCMV no se hace rutinariamente después de detectar la infección o la reactivación. Adicionalmente se sabe que este virus ejerce una compleja actividad inmunomoduladora, la cual al parecer le permite persistir en latencia en individuos inmunocompetentes, pero que en inmunosuprimidos puede facilitar la reactivación de la infección y la diseminación a diferentes compartimientos anatómicos y tejidos, hecho que puede estar relacionado con la gran variedad de complicaciones asociadas. El estudio in vitro de la actividad inmunomoduladora de HCMV se hace empleando cepas de referencia, con alto número de pasajes en cultivo celular, sin tomar en consideración las alteraciones genómicas producto de la adaptación, que pueden afectar el tropismo, la modulación inmunológica y la latencia, entre otros. Estas cepas se usan por la dificultad de obtener aislados clínicos de HCMV debido al ciclo replicativo lento y la probabilidad de coinfecciones. Es por esto por lo que se planteó evaluar y comparar la actividad inmunomoduladora in vitro de un aislado clínico de HCMV con cepas de referencia, en una línea celular de monocitos humanos. Para ello se plantearon tres estrategias metodológicas. En la primera se evalúo la posible relación entre los genotipos de HCMV con las complicaciones y el desenlace, en pacientes pediátricos receptores de trasplante de precursores hematopoyéticos (RTPH). En segundo lugar, se establecieron las condiciones metodológicas para aislar y cosechar HCMV a partir de muestras clínicas; finalmente, se evaluó y comparó in vitro la activación y expresión de mediadores inflamatorios en una línea celular de monocitos/macrófagos infectados con el aislado clínico, teniendo como referencia el efecto que inducen dos cepas de laboratorio del HCMV. A continuación, se describe la metodología y los resultados obtenidos de cada uno de los objetivos planteados. HCMV se transmite por contacto próximo a través de fluidos corporales como la orina, leche materna y saliva, por lo que la mayoría de los individuos infectados han adquirido el virus en los primeros años de vida y aparece en estos fluidos en las descargas virales asintomáticas. Por otra parte, se han identificado cinco genotipos de HCMV lo que demuestra su variabilidad genética y algunos estudios sugieren una relación entre el genotipo infectante, las coinfecciones (más de un genotipo) y el desenlace, sobre todo en RTPH. Sin embargo, hasta el momento en el país la genotipificación no es un procedimiento rutinario y no se considera a la saliva como una muestra confiable, útil para su rastreo. Para evaluar esto, se obtuvieron 105 muestras de saliva de 20 pacientes pediátricos RTPH recolectadas semanalmente en la Unidad de Trasplante de Precursores Hematopoyéticos de la Fundación Hospital Pediátrico la Misericordia (UT-HOMI). Se confirmó la infección de HCMV por PCR detectando el gen UL83; y por PCR anidada y secuenciación se determinó el genotipo. Se detectó el ADN viral en 29 muestras de 12 pacientes y en todos los casos se confirmó el genotipo gB1, sin coinfecciones. Luego del análisis no se estableció ninguna relación entre la detección de HCMV en saliva, el genotipo identificado, con las complicaciones y el desenlace en el grupo de pacientes que participó en el estudio. Este resultado confirma la alta frecuencia de HCMV en los pacientes, la factibilidad de emplear la saliva para la detección y genotipificación de HCMV y la necesidad de evaluar la relación entre el genotipo(s) identificado(s) con el curso clínico del paciente trasplantado. De otro lado, la obtención de aislados clínicos a partir de fluidos corporales puede resultar difícil, por el tiempo que puede demorar la aparición de efecto citopático (ECP) y porque en los primeros pasajes las partículas virales permanecen asociadas a las células y la concentración es baja en el sobrenadante celular. En nuestro segundo objetivo se propuso aislar el HCMV a partir de muestras de orina, lavado broncoalveolar (LBA) y plasma de pacientes hospitalizados en el HOMI. De 61 niños evaluados, se obtuvieron 6 muestras de orina, 27 de LBA y 37 plasmas. De las 9 muestras positivas por PCR para HCMV, se hicieron diluciones que se inocularon sobre células MRC-5 utilizando la técnica de centrifugación (Shell-vial), luego se retiró el inóculo y se observaron diariamente. De las 5 muestras con ECP se recolectó el sobrenadante, el cual fue inoculado nuevamente en células MRC-5. Sobre estas últimas -con ECP atribuible a HCMV- se recolectó y almacenó a -80°C el lisado celular sonicado y el sobrenadante. En las células inoculadas con plasma el cultivo mostró daño celular temprano que impidió continuar con el aislamiento. Solo a partir de una muestra de LBA -negativa para Virus Herpes Simplex 1 y 2, Adenovirus, Enterovirus y Poliomavirus-, se logró el aislamiento y amplificación de un HCMV genotipo gB1, que denominamos B52, con un título de 2.18 x106 UFP/mL, luego de su segundo pasaje. Estos resultados muestran que la obtención de aislados clínicos a partir de las descargas virales asintomáticas en fluidos como la saliva, LBA y la orina puede ser eficaz y eficiente implementando algunas estrategias técnicas como el Shell vial y lisando las células, lo que mejora los títulos y permite obtener un aislado con muy bajos pasajes en cultivo. Finalmente, luego de la infección primaria, HCMV establece latencia en las células CD34+ y persiste en los monocitos de sangre periférica CD14+. En estas células, el HCMV modula la respuesta inmunológica: i) promoviendo la activación de los monocitos circulantes y su diferenciación a macrófagos tisulares; ii) regulando la secreción de algunas citocinas y iii) reclutando células inmunes; así, genera un ambiente proinflamatorio, al tiempo que regula la respuesta inmune antiviral. Esta actividad es uno de los atributos de HCMV que lo hace altamente patogénico en individuos inmunosuprimidos, como los RTPH. Para el estudio de la actividad inmunomoduladora de HCMV comúnmente se utilizan cepas de laboratorio como Towne y Merlin, en las que por su alto o bajo número de pasajes -respectivamente- se han establecido modificaciones genómicas comprometiendo segmentos importantes que cambian el tropismo y la patogenicidad. Aun así, estas cepas son usadas con frecuencia debido a la dificultad de obtener aislados clínicos. Para evaluar el efecto del aislado clínico B52 en la activación y expresión de mediadores inflamatorios se utilizó la línea celular monocítica THP-1; las células fueron infectadas a una MOI de 1, con el aislado o con las cepas de referencia (Towne o Merlin), aplicando el modelo latencia – reactivación. Como control de diferenciación y activación celular las THP-1 fueron tratadas (+) o no tratadas (-) con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), y evaluadas a las 48, 72 y 120 horas posinfección (hpi). Al cabo de cada uno de los tiempos, se evaluó por citometría de flujo la expresión de marcadores de diferenciación CD14, CD64, CD11b, CD68 y activación celular CD206 y HLA-DR. Por RT-qPCR la expresión relativa de los transcritos para las citocinas asociadas a la activación, diferenciación y movilización de monocitos/macrófagos como IFN e IFNβ; TNF, IL-1β, CXCL-10, IL-8 e IL-10. Finalmente, en el sobrenadante se cuantificó la concentración de algunos de estos y otros mediadores como IFNγ, IL-6, CCL-18, IL-12p70, CXCL-9, IL-4, RANTES, MCP-1, CCL-22, MIP-1β, FAS-L y los factores de crecimiento VEGF-A, PDGF-AB. La expresión de marcadores de superficie de las células infectadas y tratadas con PMA mostró una expresión mayor de los marcadores CD14 y CD11b respecto al control. El efecto del aislado clínico B52 sobre la expresión de CD206 y HLA-DR fue dependiente de la estimulación con PMA y se incrementó con el tiempo. Las cepas de laboratorio Merlin y Towne indujeron una expresión más temprana de estos marcadores con disminución a las 120 hpi. La expresión relativa de los transcritos mostró que B52 moduló diferencialmente en el tiempo la expresión de los interferones y las citocinas proinflamatorias TNFα, CXCL-10, IL-1β e IL-8 y sobrereguló la expresión relativa de IL-10, respecto a las cepas Merlin y Towne. Sobre las concentraciones de citocinas y factores de crecimiento en el sobrenadante se encontró que el efecto de la infección con B52 estuvo por encima del inducido por las cepas de laboratorio en la mayoría de los casos, además de observarse en las primeras 48 horas luego de la infección. El efecto del tratamiento con PMA fue variable y no siempre significó incremento de las concentraciones de los analitos. Finalmente, en la secreción de IL-10 y de FAS-L, se observó un efecto diferencial y temprano con niveles más altos inducido por B52, principalmente en las células PMA (-), en comparación con el efecto de las cepas de laboratorio.