Guerrero Guerrero, Martha IníridaWintaco Martínez, Luz Maira2019-08-062019-08-06https://hdl.handle.net/20.500.12495/1601La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada por la bacteria Mycobacterium tuberculosis, que fue declarada en 1993 por la Organización Mundial de la Salud (OMS), como una emergencia sanitaria mundial, desde entonces los esfuerzos por controlar la enfermedad no han parado y se han diseñado diferentes estrategias para combatirla, pero su control parece estar cada vez más alejado con el surgimiento de resistencia a los diferentes medicamentos antituberculosos usados para combatir el M. tuberculosis. De esta situación se desprende la tuberculosis multidrogorresistente (TB-MDR), la cual presenta resistencia a por lo menos dos de los principales medicamentos usados en el tratamiento como son: rifampicina e isoniazida. La cual se puede convertir en tuberculosis extremadamente resistente (TB-XDR), cuando además hay resistencia a fluoroquinolonas y a un inyectable de segunda línea (capreomicina/kanamicina/amikacina). Con el objetivo de identificar y describir por primera vez en el país las mutaciones, asociados con resistencia a medicamentos antituberculosos, presentes en regiones específicas de cada uno de los siete blancos moleculares seleccionados, se tomaron del biobanco, aislamientos recolectados en los últimos 10 años: 130 aislamientos MDR y 30 aislamientos susceptibles, a los medicamentos de primera línea, junto con cepas ATCC como control; a los cuales se habían clasificados previamente por el método de referencia de las Proporciones Múltiples, usado para determinar la sensibilidad a los medicamentos antituberculosos, además se les había realizado previamente genotipificación mediante por spoligotyping. Se realizó la recuperación de los aislamientos en medio de cultivo líquido, con el fin de obtener una biomasa bacilar considerable, para realizar la posterior extracción del ADN y evaluación de la calidad del mismo, cuantificándolo correctamente. Se diseñaron siete pares de iniciadores para la amplificación de los siete blancos moleculares a amplificar: rpoB, katG, inhA, ahpC, gyrA, rrs, y tlyA, los cuales fueron seleccionados para brindar información de resistencia a medicamentos de primera y segunda línea, que contribuya a la detección de aislamientos MDR y XDR. Se realizó la estandarización de las Reacciones en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la amplificación de los 7 blancos moleculares de los aislamientos seleccionados para un total de 1120 amplificaciones. Se purificaron los productos amplificados, para realizar su secuenciación automática mediante el analizador genético ABI PRISMA® 3100 Applied Biosystems, USA. Los resultados de estas secuenciaciones se analizaron con el software SeqScape v.3.0 de Applied Biosystems, diseñado para la detección, análisis y confirmación de mutaciones. En el gen rpoβ de los aislamientos colombianos MDR encontramos las mutaciones ya descritas en proporciones similares a las reportadas, siendo S531L, la más frecuente y además encontramos 6 mutaciones no reportadas previamente (D435V, V477M, E588K, S600T, I603S, V662F) las cuales podrían conferirles resistencia a rifampicina porque a pesar de estar fuera de región RRDR, no son sinónimas ni fueron encontradas combinadas con otras ya reportadas como causantes de resistencia a rifampicina. Entre los 130 aislamientos MDR, el 44,6% presentaron la mutación S315T en el gen katG, mutación que se ha reportado que ocurre a distintas tasas en los diferentes países y por otra parte, encontramos otras mutaciones en el codón 315 (S315N, S315I) y además, el 28% de estos aislamientos MDR portan mutaciones en codones diferentes al 315, los cuales también pasarían desapercibidas por los métodos comerciales. El 9,2% y el 22,9% de los aislamientos colombianos no presentan mutaciones en el en rpoβ y katG respectivamente. En lo referente al estudio de los blancos moleculares para detección de resistencia a medicamentos de segunda línea: gyrA, tlyA y rrs, nuestros resultados son los primeros que se realizan con aislamientos de todo el país y los únicos con un número considerable de aislamientos MDR, por lo tanto son de gran valor en el contexto de la salud pública y de la resistencia a los medicamentos. En el gen gyrA, se encontró una alta proporción (94%) de aislamientos con la mutación S95T, esta mutación se ha reportado en aislamientos de Venezuela y de China y no se encuentra asociada con resistencia a las fluoroquinolonas. La mutación en el codón 94, fuertemente asociada con resistencia a fluoroquinolonas, es exótica porque solo 1 aislamiento la presentó pero en cambio, detectamos tres sitios calientes para mutaciones en los aislamientos colombianos. Teniendo en cuenta que mutaciones de resistencia a fluoroquinolonas en los aislamientos MDR, son marcadores de aislamientos pre-XDR, nuestros hallazgos en gyrA (12,8% con mutaciones), cobran gran importancia en el contexto nacional, por lo cual deben ser vigilados y estudiados más profundamente. Los genes tlyA y rrs han sido menos estudiados que gyrA, por lo tanto nuestros hallazgos son novedosos y permiten ratificar que hace falta realizar más estudios al respecto para dilucidar su contribución real en la detección de aislamientos XDR. Para el gen tlyA en los aislamientos colombianos encontramos una gran proporción (75%), con mutación en el codón 235, (A235A) que es una mutación sinónima. Además de la mutación en 235, 20 aislamientos presentaron una o varias mutaciones en otros codones que deben estudiarse más profundamente para confirmar si existe asociación verdadera con la resistencia a kanamicina, amikacina o capreomicina. En el gen rrs se encontró alta frecuencia (33%) de los aislamientos con mutaciones en el codón 467, presentando 8 genotipos diferentes, previamente reportado en algunos estudios como fuertemente implicado en resistencia a kanamicina, amikacina o capreomicina pero no en otros estudios. La variabilidad de los reporte podría explicarse por la presencia de diferentes genotipos en los cuales 4 son mutaciones no sinónimas y 3 dan codón de parada, existiendo una mutación sinónima. Nuestro hallazgo de mutaciones en otros codones diferentes al 467, requiere más estudios para confirmar su relevancia en la detección de aislamientos XDR. El gran número de aislamientos analizados en el presente estudio permiten asegurar que existe una fuerte asociación entre las mutaciones detectadas en los genes rpoB y katG con la resistencia a medicamentos de primera línea rifampicina e isoniazida respectivamente mientras que simultáneamente podemos afirmar que las mutaciones en inhA y ahpC no están fuertemente asociadas con resistencia a isoniazida en los aislamientos colombianos. Por otra parte, a partir de este estudio podríamos contar con dos blancos moleculares ampliamente útiles en la detección de aislamientos XDR como son gyrA, rrs y además un blanco posiblemente útil para este efecto como sería tlyA. De lo detectado en el estudio de gyrA, tlyA y rrs, se concluye que la presencia de aislamientos XDR, entre los MDR, no sobrepasa el 12%, lo cual es alentador en el sentido de que la MDR en Colombia se encuentra alrededor del 5% y por lo tanto la XDR no alcanzaría a llegar al 1%. En conclusión, en el presente trabajo se ha generado nuevo conocimiento científico, describiendo por primera vez las mutaciones identificadas en un número significativo de aislamientos colombianos de Mycobacterium tuberculosis MDR/XDR, que confieren resistencia a los medicamentos de primera y segunda línea, lo cual servirá como insumo para el desarrollo de metodologías moleculares rápidas y adecuadas, útiles en la detección de tales aislamientos.application/pdfspaAttribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 InternationalTrabajo de gradoW 50instname:Universidad El Bosquereponame:Repositorio Institucional Universidad El Bosquerepourl:https://repositorio.unbosque.edu.coAcceso abiertoinfo:eu-repo/semantics/openAccesshttps://purl.org/coar/access_right/c_abf22014