Estudio de las características biológicas de Sarconesiopsis magellanica y análisis bioquímico de sus excreciones y secreciones larvales
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2013
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Resumen
Sarconesiopsis magellanica es una mosca necrófaga de importancia médica y forense, utilizada para establecer el intervalo post-mortem. Las larvas de dípteros liberan enzimas proteolíticas contenidas en los productos de las excreciones y secreciones larvales (ES), que juegan un papel muy importante en procesos digestivos y en la curación de las heridas crónicas, ya que degradan tejido necrótico durante la terapia larval. Este proceso promueve el desbridamiento, la desinfección y la estimulación del tejido de granulación; adicionalmente, las ES tienen un papel importante en el aumento de la proliferación, adhesión y migración de células involucradas en la curación de heridas. El objetivo del presente trabajo fue estudiar las características biológicas de S. magellanica y analizar bioquímicamente las enzimas proteolíticas derivadas de las ES. Para tal fin, se colonizó la especie bajo condiciones controladas de laboratorio, se evaluó su ciclo biológico y se analizó su mortalidad, supervivencia, parámetros reproductivos y poblacionales, a partir de tablas de vida. Las proteínas de las ES fueron separadas por SDS – PAGE y su actividad proteolítica fue caracterizada por zimogramas y ensayos de inhibición sobre los sustratos BAPNA y SAPNA. Por otro lado, se evaluó la viabilidad y proliferación en células epiteliales a través del ensayo de MTT, analizando además la morfología, adhesión y migración celular. El ciclo de vida más corto fue para los individuos alimentados con la dieta de hígado en polvo (HP). Los parámetros poblacionales fueron: Tasa neta de reproducción (Ro) =447,752±17,15, Tiempo medio generacional (Tc) =18,18±0,67, Tasa intrínseca de crecimiento natural poblacional (rm) =0,145 y Tasa finita de incremento poblacional (λ) =1,398. En relación con el perfil proteico de las ES, se encontró la presencia de bandas entre ~69 kDa y ~23 kDa, coincidiendo varias de ellas con las del perfil de Lucilia sericata. La actividad de las serin-proteasas fue confirmada cuando una banda de ~25kDa desapareció bajo la incubación de las ES con PMSF a pH 7,8. Los análisis sobre los sustratos sugirieron una gran cantidad de proteasas de tipo tripsina. Por otro lado, estas ES no afectaron la viabilidad de células epiteliales, induciendo un aumento en la proliferación celular. Adicionalmente, reducen la adhesión y estimulan la migración celular a través de la matriz extracelular. Las ES redujeron la superficie celular e incrementaron las alteraciones morfológicas. Los parámetros antes mencionados se ven disminuidos al incubar las ES a 60ºC, posiblemente debido a la inhibición de las proteasas. Estos datos sugieren que las enzimas proteolíticas contenidas dentro de las ES de S. magellanica,
contribuyen en la formación del tejido de granulación, facilitando el proceso de regeneración, aumentan la migración de células, promueven la proliferación y aceleran la remodelación de la matriz extracelular. Estos resultados, en su conjunto, dan soporte a futuros experimentos encaminados a la validación de S. magellanica en terapia larval.
Descripción
Abstract
Sarconesiopsis magellanica is a necrophagous blowfly relevant in both forensic and medical sciences; it has been of great use for determining the post-mortem interval. Larvae from Diptera release proteolytic enzymes present if their excretions/secretions (ES) that play an important role in digestive processes and in chronic wound healing, by degrading necrotic tissue during larval therapy. This process promotes debridement, disinfection and granulation tissue formation; ES also play an important role increasing proliferation, adhesion and migration of cells involved in wound healing. The present study was aimed at studying S. magellanica biological characteristics and analyzing by biochemical techniques the enzymes present in larval ES. A colony of this blowfly was thus established under laboratory conditions, analyzing the biological cycle, mortality and survival rates, reproductive and population parameters based on life tables. Proteins present in larval ES were size-separated by SDS-PAGE and their proteolytic activity was assessed by zymography and inhibition assays using BAPNA and SAPNA as substrates. Epithelial cell viability and proliferation were also determined by MTT assays, as well as morphology, adhesion and cell migration. The shortest life cycle was for subjects fed on powdered liver (PL). Population parameters were: net reproductive rate (Ro) =447.752±17.15, mean generational time (Tc) =18.18±0.67, natural population increase rate (rm) =0.145 and finite population increase rate (λ) =1.398. Regarding the ES protein profile, bands ranging from ~69 kDa and ~23 kDa bands were found, several of them coinciding with the ones found in Lucilia sericata. Serine-protease activity was confirmed when a ~25 kDa band was absent upon ES incubation with PMSF at pH 7.8. Substrate assays suggested abundant trypsin-like proteases. ES did not affect epithelial cell viability, inducing an increase in cell proliferation; cell adhesion was reduced, while cell migration through extracellular matrix increased. ES induced also a decreased cell surface and morphological alterations. Changes in all the above-mentioned parameters are reduced when ES are incubated at 60ºC, most likely due to protease inhibition.
These results suggest that proteolytic enzymes present in S. magellanica larval ES contribute towards granulation tissue formation (thus helping the regeneration process), increase cell migration, promote proliferation and speed-up extracellular matrix remodeling. All these data support carrying out further experiments aimed at validating S. magellanica usefulness in larval therapy.
Palabras clave
Sarconesiopsis magellanica, Ciclo de vida, Enzimas proteolíticas, Terapia larval, Excreciones y secreciones larvales
Keywords
Sarconesiopsis magellanica, Life cycle, Proteolytic enzymes, Larval therapy, Larval excretions/secretions
Temáticas
Dípteros
Sarcofágidos
Miasis
Sarcofágidos
Miasis