Evaluación del biomarcador I tipo sRNA como blanco para la detección de infección por Mycobacterium tuberculosis en muestras de orina
No hay miniatura disponible
Archivos
Fecha
2024-08
Autores
Título de la revista
Publicado en
Publicado por
URL de la fuente
Enlace a contenidos multimedia
ISSN de la revista
Título del volumen
Resumen
La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis (Mtb), y afecta principalmente los pulmones (tuberculosis pulmonar, TBP), aunque también puede comprometer otros órganos, denominándose tuberculosis extrapulmonar (TBE). La TB se transmite por vía aérea, y su control depende del diagnóstico y tratamiento temprano. Sin embargo, el diagnóstico en niños es especialmente desafiante debido a la naturaleza paucibacilar de las muestras. Los métodos diagnósticos actuales, como el cultivo (Gold estándar) y las pruebas moleculares (GeneXpert-Ultra), se basan en la detección del patógeno en muestras pulmonares, pero presentan limitaciones en esta población.
Recientemente, los ARN pequeños no codificantes (sRNA) provenientes del huésped o del patógeno han surgido como biomarcadores prometedores para el desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico. Este estudio evaluó un sRNA específico de Mtb, denominado sRNA-TBC, como posible biomarcador para detectar TB activa en muestras de orina de niños con sospecha de TB activa mediante RT-qPCR. Para ello, se construyó un plásmido recombinante utilizando el vector pGEM®-T Easy (Promega) para clonar la secuencia de interés (sRNA-TBC). Este plásmido, que contiene la región promotora T7, permitió la transcripción in vitro mediante ARN polimerasa T7, obteniendo un ARN transcrito de alta calidad con una concentración de 1720 ng/μL.
Para determinar la sensibilidad analítica del ensayo de RT-qPCR, se generaron curvas de calibración en dos matrices. Los resultados demostraron que el ensayo logró detectar concentraciones tan bajas como 0.001 fg/μL en agua DEPC y 0.1 fg/μL en orina sana inoculada con el transcrito sRNA-TBC utilizando Sybr Green. Además, se evaluó la detección del biomarcador en 45 muestras de orina de niños con sospecha de TB activa, previamente recolectadas y almacenadas por el Grupo de Micobacterias del CIB. Después de realizar la extracción de ARN, síntesis de ADNc y amplificación mediante RT-qPCR, no hubo amplificación del producto esperado en ninguna de las muestras evaluadas. Estos resultados coinciden con las pruebas microbiológicas y moleculares realizadas por la CIB en muestras pulmonares y extrapulmonares de los mismos pacientes, confirmando que todos fueron negativos y corroborando la ausencia de falsos positivos mediante la técnica de RT-qPCR.
Aunque el biomarcador sRNA-TBC muestra potencial para el diagnóstico de TB, es necesario continuar los estudios para optimizar su validación. Esto incluye la evaluación de su rendimiento en una cohorte más amplia que incluya muestras de orina verdaderamente positivas de niños y adultos. Además, validar el uso de la orina como muestra no invasiva podría mejorar la accesibilidad y aceptación del diagnóstico de TB, especialmente en poblaciones pediátricas.
Descripción
Abstract
Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), and primarily affects the lungs (pulmonary tuberculosis, PTB), although it can also involve other organs, being called extrapulmonary tuberculosis (ETB). TB is transmitted by air, and its control depends on early diagnosis and treatment. However, diagnosis in children is especially challenging due to the paucibacillary nature of the samples. Current diagnostic methods, such as culture (Gold standard) and molecular tests (GeneXpert-Ultra), are based on the detection of the pathogen in lung samples, but have limitations in this population.
Recently, small non-coding RNAs (sRNA) from the host or the pathogen have emerged as promising biomarkers for the development of new diagnostic methods. This study evaluated an Mtb-specific sRNA, called sRNA-TBC, as a potential biomarker to detect active TB in urine samples from children with suspected active TB by RT-qPCR. For this purpose, a recombinant plasmid was constructed using the pGEM®-T Easy vector (Promega) to clone the sequence of interest (sRNA-TBC). This plasmid, which contains the T7 promoter region, allowed in vitro transcription by T7 RNA polymerase, obtaining a high-quality transcribed RNA with a concentration of 1720 ng/μL.
To determine the analytical sensitivity of the RT-qPCR assay, calibration curves were generated in two matrices. The results showed that the assay was able to detect concentrations as low as 0.001 fg/μL in DEPC water and 0.1 fg/μL in healthy urine inoculated with the sRNA-TBC transcript using Sybr Green. In addition, the detection of the biomarker was evaluated in 45 urine samples from children with suspected active TB, previously collected and stored by the CIB Mycobacteria Group. After performing RNA extraction, cDNA synthesis and amplification by RT-qPCR, there was no amplification of the expected product in any of the samples evaluated. These results coincide with the microbiological and molecular tests performed by the CIB on pulmonary and extrapulmonary samples from the same patients, confirming that all were negative and corroborating the absence of false positives using the RT-qPCR technique.
Although the sRNA-TBC biomarker shows potential for TB diagnosis, further studies are needed to optimize its validation. This includes evaluating its performance in a broader cohort that includes truly positive urine samples from children and adults. In addition, validating the use of urine as a noninvasive sample could improve the accessibility and acceptance of TB diagnosis, especially in pediatric populations.
Palabras clave
Biomarcador, Diagnostico, Infección, Tuberculosis, sRNA
Keywords
Biomarker, Diagnosis, Infection, Tuberculosis, sRNA