Evaluación del RT-LAMP y la PCR digital como métodos moleculares para la detección del virus del dengue: desde un ensayo sencillo y accesible a otro altamente sensible y sofisticado
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Resumen
El dengue es una enfermedad arboviral de amplia distribución en regiones tropicales y subtropicales, donde la circulación simultánea de los cuatro serotipos del virus del dengue (DENV-1 a DENV-4) genera brotes recurrentes y una elevada carga para los sistemas de salud. El diagnóstico oportuno se ve limitado por la disponibilidad de plataformas de RT-qPCR en muchos laboratorios, lo que hace necesario evaluar metodologías moleculares alternativas de fácil implementación y, a la vez, explorar herramientas de alta sensibilidad para la cuantificación absoluta del ARN viral.
El objetivo de este estudio fue implementar y validar metodologías moleculares basadas en RT-LAMP y PCR digital para la detección del virus del dengue en muestras biológicas de pacientes febriles con sospecha de infección y en individuos asintomáticos. Para lo cual, se evaluó un set de oligonucleótidos PanDENV y se diseño un set de serotipificación para RT-LAMP en formatos colorimétrico y fluorométrico, se determinó su sensibilidad y especificidad analítica frente a controles de los cuatro serotipos y a otros arbovirus, y se comparó su desempeño clínico con RT-PCR anidada, RT-qPCR implementadas en el laboratorio y un kit comercial de RT-qPCR en 100 muestras de pacientes pediátricos. Adicionalmente, se implementó el método de PCR para cuantificar cosechas virales y se evaluó su utilidad en 100 sueros de donantes de sangre asintomáticos.
El RT-LAMP serotipo-específico alcanzó límites de detección del orden de 100 a 1000 copias de ARN/reacción y no mostró reactividad cruzada con otros arbovirus. En la evaluación clínica, el RT-LAMP colorimétrico mostró una sensibilidad moderada y mantuvo una alta especificidad. La PCR digital permitió la cuantificación absoluta de las cosechas virales de los cuatro serotipos, pero no detectó ARN de DENV en los donantes evaluados, a pesar de resultados positivos previos por RT-PCR anidada.
En conjunto, estos resultados respaldan el uso del RT-LAMP como alternativa diagnóstica rápida y de bajo costo en contextos con infraestructura limitada, y señalan a la PCR digital como una herramienta promisoria para estudios de cuantificación viral y seguridad transfusional, cuyo uso rutinario requiere aún mayor evaluación.
Descripción
Abstract
Dengue is an arboviral disease widely distributed in tropical and subtropical regions, where the simultaneous circulation of the four dengue virus serotypes (DENV-1 to DENV-4) leads to recurrent outbreaks and a high burden on health systems. Early diagnosis is often limited by the availability of RT-qPCR platforms in many laboratories, which makes it necessary to evaluate alternative molecular methodologies that are easy to implement and, at the same time, to explore highly sensitive tools for the absolute quantification of viral RNA.
The aim of this study was to implement and validate molecular methods based on RT-LAMP and digital PCR for the detection of dengue virus in biological samples from febrile patients with suspected infection and from asymptomatic individuals. To this end, a PanDENV primer set was evaluated and a serotype-specific primer set for RT-LAMP was designed in colorimetric and fluorometric formats. Their analytical sensitivity and specificity were determined using controls for the four serotypes and other arboviruses, and their clinical performance was compared with nested RT-PCR, in-house RT-qPCR assays, and a commercial RT-qPCR kit in 100 samples from pediatric patients. Additionally, the digital PCR method was implemented to quantify viral stocks and its usefulness was assessed in 100 serum samples from asymptomatic blood donors.
The serotype-specific RT-LAMP assay achieved limits of detection in the range of 100 to 1,000 RNA copies per reaction and showed no cross-reactivity with other arboviruses. In the clinical evaluation, colorimetric RT-LAMP showed moderate sensitivity while maintaining high specificity. Digital PCR enabled the absolute quantification of viral stocks of the four serotypes but did not detect DENV RNA in the donors tested, despite previous positive results by nested RT-PCR.
Taken together, these findings support the use of RT-LAMP as a rapid, low-cost diagnostic alternative in settings with limited infrastructure, and identify digital PCR as a promising tool for viral load quantification and transfusion safety, whose routine use still requires further evaluation.
Palabras clave
Dengue virus, Detección molecular, RT-LAMP, PCR digital