Producción de una Peptidil arginina deiminasa de Porphyromonas gingivalis (PPAD) de manera recombinante
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2018
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Resumen
La enzima Peptidil arginina deiminasa producida por P. gingivalis (PPAD) induce la conversión de la arginina en citrulina en proteínas bacterianas y humanas; favoreciendo la producción de anticuerpos contra proteínas citrulinadas. Varios estudios han evaluado la relación entre anticuerpos anti-PPAD y un aumento en la actividad de la artritis reumatoide (AR), aún existe controversia en este aspecto. De ahí la importancia en evaluar la presencia de anti-PPAD en pacientes con AR siendo indispensable la PPAD recombinante como antígeno para evaluar anticuerpos en individuos con AR. Producir una PPAD-NT recombinante. Se diseñaron primers para el fragmento N-terminal, basados en la secuencia de la PPAD almacenada en la base de datos del NCBI. Posteriormente el fragmento N-terminal fue amplificado por PCR y clonado en el plásmido pGEM-R-T para la propagación del inserto, la transformación se realizó en Escherichia coli. Top 10. El inserto se rastreó por PCR, los clones se propagaron y se realizó extracción. Se realizó la restricción del inserto con las enzimas Xbal y Nsil y se clono de nuevo en el plásmido de expresión pET-CT, y se transformó en E.coli BL21. Se realizó el rastreo de clones y se confirmódireccionalidad del inserto por PCR. Posteriormente se indujo la expresión de la proteína con IPTG 1mM evaluada por SDS-PAGE en sobrenadantes y pellets celulares a diferentes tiempos (2, 4, 6 y 18 horas) para confirmar la producción de la proteína. Se confirmó la producción de la PPAD-NT recombinante en los pellets celulares con un fragmento de aproximadamente 25kDa a las dos horas de inducción, no se encontró la proteína en los sobrenadantes, lo que indica que la proteína no se encuentra de manera soluble, lo que requiere de otros métodos para lograr la purificación soluble de la PPAD-T. Se produjo con éxito la PPAD-NT recombinante, aunque de manera insoluble.
Descripción
Abstract
The Peptidylarginine deiminase enzyme produced by P. gingivalis (PPAD) induces the conversion of arginine from citrulline into bacterial and human protein favouring the production of antibodies against citrullinated proteins. Several studies have evaluated the relation between anti-PPAD antibodies and an increase in rheumatoid arthritis (RA) but there is still controversy regarding it. Thus stems the importance of evaluating the presence of anti-PPAD in patients with RA. The recombinant PPAD is indispensable as an antige for antibody evaluation in individuals with RA. To produce a recombinant PPAD-NT. Primers were designed for the N-terminal fragment based on the PPAD sequence filed in the NCBI database. Afterwards the N-terminal was PCR amplified and cloned in the pGEM-R-T plasmid for insert propagation, the transformation was carried out in Escherichia coli. Top 10. The insert was tracked with PCR, the clones propagated and the extraction carried out. Insert restriction was carried out with Xbal and Nsil enzymes, re-cloned in the plasmid with pET-CT expression and transformed into E. coli BL21. Clone tracking was done and insert direction was confirmed with PCR. Afterwards protein expression was induced with IPTG 1mM evaluated by SDS-PAGE in supernatants and cellular pellets in different times (2 hours, 4 hours, 6 hours and 18 hours) in order to confirm protein production. Results: Production of recombinant PPAD-NT was confirmed two hours after induction in the cellular pellets with a fragment of approximately 25kDa. No protein was found in the supernatants which indicates that the protein is found in a soluble state, requiring other methods for soluble purification of PPAD-NT. Recombinant PPAD-NT was successfully produced even though in an insoluble state.