Caracterización de las mutaciones presentes en aislamientos colombianos de Mycobacterium tuberculosis multirresistentes, como insumo para el desarrollo de una metodología molecular para el diagnóstico de tuberculosis multidrogorresistente y extremadamente resistente
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Resumen
La tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada por la bacteria Mycobacterium tuberculosis, que fue declarada en 1993 por la Organización Mundial de la Salud (OMS), como una emergencia sanitaria mundial, desde entonces los esfuerzos por controlar la enfermedad no han parado y se han diseñado diferentes estrategias para combatirla, pero su control parece estar cada vez más alejado con el surgimiento de resistencia a los diferentes medicamentos antituberculosos usados para combatir el M. tuberculosis. De esta situación se desprende la tuberculosis multidrogorresistente (TB-MDR), la cual presenta resistencia a por lo menos dos de los principales medicamentos usados en el tratamiento como son: rifampicina e isoniazida. La cual se puede convertir en tuberculosis extremadamente resistente (TB-XDR), cuando además hay resistencia a fluoroquinolonas y a un inyectable de segunda línea (capreomicina/kanamicina/amikacina).
Con el objetivo de identificar y describir por primera vez en el país las mutaciones, asociados con resistencia a medicamentos antituberculosos, presentes en regiones específicas de cada uno de los siete blancos moleculares seleccionados, se tomaron del biobanco, aislamientos recolectados en los últimos 10 años: 130 aislamientos MDR y 30 aislamientos susceptibles, a los medicamentos de primera línea, junto con cepas ATCC como control; a los cuales se habían clasificados previamente por el método de referencia de las Proporciones Múltiples, usado para determinar la sensibilidad a los medicamentos antituberculosos, además se les había realizado previamente genotipificación mediante por spoligotyping.
Se realizó la recuperación de los aislamientos en medio de cultivo líquido, con el fin de obtener una biomasa bacilar considerable, para realizar la posterior extracción del ADN y evaluación de la calidad del mismo, cuantificándolo correctamente. Se diseñaron siete pares de iniciadores para la amplificación de los siete blancos moleculares a amplificar: rpoB, katG, inhA, ahpC, gyrA, rrs, y tlyA, los cuales fueron seleccionados para brindar información de resistencia a medicamentos de primera y segunda línea, que contribuya a la detección de aislamientos MDR y XDR. Se realizó la estandarización de las Reacciones en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la amplificación de los 7 blancos moleculares de los aislamientos seleccionados para un total de 1120 amplificaciones. Se purificaron los productos amplificados, para realizar su secuenciación automática mediante el analizador genético ABI PRISMA® 3100 Applied Biosystems, USA. Los resultados de estas secuenciaciones se analizaron con el software SeqScape v.3.0 de Applied Biosystems, diseñado para la detección, análisis y confirmación de mutaciones.
En el gen rpoβ de los aislamientos colombianos MDR encontramos las mutaciones ya descritas en proporciones similares a las reportadas, siendo S531L, la más frecuente y además encontramos 6 mutaciones no reportadas previamente (D435V, V477M, E588K, S600T, I603S, V662F) las cuales podrían conferirles resistencia a rifampicina porque a pesar de estar fuera de región RRDR, no son sinónimas ni fueron encontradas combinadas con otras ya reportadas como causantes de resistencia a rifampicina.
Entre los 130 aislamientos MDR, el 44,6% presentaron la mutación S315T en el gen katG, mutación que se ha reportado que ocurre a distintas tasas en los diferentes países y por otra parte, encontramos otras mutaciones en el codón 315 (S315N, S315I) y además, el 28% de estos aislamientos MDR portan mutaciones en codones diferentes al 315, los cuales también pasarían desapercibidas por los métodos comerciales. El 9,2% y el 22,9% de los aislamientos colombianos no presentan mutaciones en el en rpoβ y katG respectivamente.
En lo referente al estudio de los blancos moleculares para detección de resistencia a medicamentos de segunda línea: gyrA, tlyA y rrs, nuestros resultados son los primeros que se realizan con aislamientos de todo el país y los únicos con un número considerable de aislamientos MDR, por lo tanto son de gran valor en el contexto de la salud pública y de la resistencia a los medicamentos.
En el gen gyrA, se encontró una alta proporción (94%) de aislamientos con la mutación S95T, esta mutación se ha reportado en aislamientos de Venezuela y de China y no se encuentra asociada con resistencia a las fluoroquinolonas. La mutación en el codón 94, fuertemente asociada con resistencia a fluoroquinolonas, es exótica porque solo 1 aislamiento la presentó pero en cambio, detectamos tres sitios calientes para mutaciones en los aislamientos colombianos.
Teniendo en cuenta que mutaciones de resistencia a fluoroquinolonas en los aislamientos MDR, son marcadores de aislamientos pre-XDR, nuestros hallazgos en gyrA (12,8% con mutaciones), cobran gran importancia en el contexto nacional, por lo cual deben ser vigilados y estudiados más profundamente.
Los genes tlyA y rrs han sido menos estudiados que gyrA, por lo tanto nuestros hallazgos son novedosos y permiten ratificar que hace falta realizar más estudios al respecto para dilucidar su contribución real en la detección de aislamientos XDR.
Para el gen tlyA en los aislamientos colombianos encontramos una gran proporción (75%), con mutación en el codón 235, (A235A) que es una mutación sinónima. Además de la mutación en 235, 20 aislamientos presentaron una o varias mutaciones en otros codones que deben estudiarse más profundamente para confirmar si existe asociación verdadera con la resistencia a kanamicina, amikacina o capreomicina.
En el gen rrs se encontró alta frecuencia (33%) de los aislamientos con mutaciones en el codón 467, presentando 8 genotipos diferentes, previamente reportado en algunos estudios como fuertemente implicado en resistencia a kanamicina, amikacina o capreomicina pero no en otros estudios. La variabilidad de los reporte podría explicarse por la presencia de diferentes genotipos en los cuales 4 son mutaciones no sinónimas y 3 dan codón de parada, existiendo una mutación sinónima. Nuestro hallazgo de mutaciones en otros codones diferentes al 467, requiere más estudios para confirmar su relevancia en la detección de aislamientos XDR.
El gran número de aislamientos analizados en el presente estudio permiten asegurar que existe una fuerte asociación entre las mutaciones detectadas en los genes rpoB y katG con la resistencia a medicamentos de primera línea rifampicina e isoniazida respectivamente mientras que simultáneamente podemos afirmar que las mutaciones en inhA y ahpC no están fuertemente asociadas con resistencia a isoniazida en los aislamientos colombianos.
Por otra parte, a partir de este estudio podríamos contar con dos blancos moleculares ampliamente útiles en la detección de aislamientos XDR como son gyrA, rrs y además un blanco posiblemente útil para este efecto como sería tlyA.
De lo detectado en el estudio de gyrA, tlyA y rrs, se concluye que la presencia de aislamientos XDR, entre los MDR, no sobrepasa el 12%, lo cual es alentador en el sentido de que la MDR en Colombia se encuentra alrededor del 5% y por lo tanto la XDR no alcanzaría a llegar al 1%.
En conclusión, en el presente trabajo se ha generado nuevo conocimiento científico, describiendo por primera vez las mutaciones identificadas en un número significativo de aislamientos colombianos de Mycobacterium tuberculosis MDR/XDR, que confieren resistencia a los medicamentos de primera y segunda línea, lo cual servirá como insumo para el desarrollo de metodologías moleculares rápidas y adecuadas, útiles en la detección de tales aislamientos.
Descripción
Abstract
Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis, which was declared in 1993 by the World Health Organization (WHO) as a global health emergency, since efforts to control the disease have not stopped and different strategies have been designed to combat it, but their control appears to be increasingly distant with the emergence of resistance to various anti-TB drugs used to combat M. tuberculosis. In this situation the multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) is apparent, which is resistant to at least two of the main drugs used in treatment such as: rifampicin and isoniazid. Which can become extremely resistant tuberculosis (XDR-TB), where there is also resistance to fluoroquinolones and second-line injectable (capreomycin / kanamycin / amikacin).
In order to identify and describe for the first time in the country the mutations associated with resistance to TB drugs, present in specific of each of the seven selected molecular targets regions, were taken from the biobank, isolates collected in the past 10 years: 130 MDR isolates and 30 susceptible isolates to first-line drugs, along with ATCC strains as control; to which had been previously classified by the reference method of Multiple Proportions, used to determine the susceptibility to TB drugs also previously undergone by genotyping by spoligotyping.
Recovery of isolates in liquid medium was carried out in order to obtain a considerable bacillary biomass for subsequent extraction of the DNA and evaluation of its quality, with quantified correctly. Seven pairs of primers for amplification of the seven molecular amplified targets were designed: rpoB, katG, inhA, ahpC, gyrA, rrs, and tlyA, which were selected to provide information about drug resistance and that contribute to the detection of MDR isolates and XDR. Standardizing the reactions performed in polymerase chain (PCR) for amplification of the seven molecularly selected for a total of 1120products. Amplified products were purified, for automatic sequencing through PRISMA® ABI 3100 Genetic Analyzer Applied Biosystems, USA. The results of this sequencing were analyzed using Applied Biosystems SeqScape v.3.0 software designed for the detection, analysis and confirmation of mutations.
In rpoβ gene Colombian isolates MDR find mutations already described in similar proportions to those reported being S531L, the most common and also found six mutations not previously reported (D435V, V477M, E588K, S600T, I603S, V662F) which could confer resistance to rifampicin because despite being out of RRDR region are not synonymous nor were found combined with other already reported to cause resistance to rifampicin.
Among the 130 MDR isolates, 44.6% had the S315T mutation in the katG gene mutation that has been reported to occur at different rates in different countries and on the other hand, we find other mutations at codon 315 (S315N, S315I) and furthermore, 28% of these MDR isolates carry mutations in different codons to 315, which also go unnoticed by commercial methods. The 9.2% and 22.9% of the isolates do not have mutations in the katG and in rpoβ respectively.
Regarding the study of the molecular targets for detection of resistance to second-line drugs: gyrA, rrs and tlyA, our results are the first to be performed with isolates from around the country and the only one with a substantial number of MDR isolates, therefore are of great value in the context of public health and drug resistance.
In the gyrA gene, a high proportion (94%) of isolates with the S95T mutation was found; this mutation has been reported in isolates from Venezuela and China and not associated with resistance to fluoroquinolones. The mutation at codon 94, strongly associated with fluoroquinolone resistance, because only one is exotic introduced isolation but instead detected three hot spots for mutations in all the isolates.
Given that mutations in fluoroquinolone resistance in MDR isolates, are markers of pre-TB isolates, our findings in gyrA (12.8% mutations), loom large in the national context, and therefore should be monitored and studied more deeply.
The tlyA and rrs genes have been less studied than gyrA therefore our findings are novel and allow ratify it takes to perform more studies to elucidate its actual contribution in the detection of XDR isolates.
For tlyA gene in all the isolates found a large proportion (75%) with mutation at codon 235 (A235A) is a synonymous mutation. In addition to the mutation at 235, 20 isolates had one or more mutations in other codons to be studied further to confirm whether there is a real association with resistance to kanamycin, amikacin or capreomycin.
In rrs gene, a high frequency (33%) isolates with mutations in codon 467 was found, presenting 8 different genotypes previously reported in some studies to be strongly implicated in resistance to kanamycin, amikacin or capreomycin but not in other studies. The variability of the report could be explained by the presence of different genotypes in which 4 are non-synonymous mutations and 3 give stop codon, a synonymous mutation exist. Our finding of mutations in codons other than the 467, requires further studies to confirm its significance in the detection of XDR isolates.
The large number of isolates analyzed in this study allow us to ensure that there is a strong association between the mutations detected in the rpoB and katG genes with resistance to rifampicin and isoniazid first line drugs respectively while simultaneously it was found that mutations in inhA and ahpC are not strongly associated with isoniazid resistance in Colombian isolates.
Moreover, from this study we could have two molecularly targets widely useful in detecting isolates XDR like gyrA, rrs useful for this purpose and possibly plus tlyA.
By showed in the gyrA, tlyA and rrs study, it is concluded that the presence of isolates XDR among MDR does not exceed 12%, which is encouraging in the sense that the MDR in Colombia is about 5% and thus the XDR not reach more than 1%.
In conclusion, this work has generated new scientific knowledge, describing first the mutations identified in a significant number of Colombian isolates of Mycobacterium tuberculosis MDR / XDR, which confer resistance to drugs of first and second line, which will as input for the development of rapid and appropriate, useful in detecting molecular methodologies such isolates.