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Implementación de técnicas moleculares para diagnóstico y epidemiología de la enfermedad de Chagas y leishmaniasis en Colombia
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Resumen
La enfermedad de Chagas y las leishmaniasis son enfermedades de gran importancia epidemiológica en Colombia. Las técnicas moleculares proporcionan herramientas que facilitan el estudio de estas enfermedades. Por esta razón, el objetivo de este estudio fue la implementación de técnicas moleculares que permitan mejorar el diagnóstico y realizar estudios de epidemiología molecular en el país.
Se recolectaron 708 muestras de pacientes con enfermedad de Chagas, 245 triatominos y 39 reservorios. Se aplicaron las siguientes técnicas moleculares: PCR convencional y tiempo real para diagnóstico, cuantificación y genotipificación de T. cruzi en muestras de pacientes, triatóminos y reservorios. PCR-HRM para determinación de fuentes alimenticias de triatóminos. Análisis de microsatélites en muestras de pacientes, triatominos y reservorios involucrados en brotes de transmisión oral. Lo anterior, con el fin de determinar las capacidades operativas de las técnicas moleculares, cargas parasitarias y DTUs en pacientes con enfermedad de Chagas. Adicionalmente, conocer los índices de infección triatominica, DTUs y preferencias alimenticias de triatominos en el país y realizar análisis de epidemiología molecular en dos brotes de transmisión oral en Colombia. En cuanto a Leishmaniasis, se incluyeron en el estudio aislamientos obtenidos de pacientes con Leishmaniasis cutánea, flebótomos y reservorios. Se realizó el diseño de un PCR-HRM para la identificación de las seis especies de Leishmania spp descritas previamente en el país. Se implementó la amplificación y secuenciación del gen citocromo b para identificación de especies de Leishmania spp.
En enfermedad de Chagas, el desempeño diagnóstico de las pruebas moleculares fue mejor en fase aguda que en fase crónica de la enfermedad. Se observaron diferencias estadísticamente significativas entre las cargas parasitarias según la fase clínica. Se reafirma la amplia distribución de la DTU TcI en pacientes, triatominos y reservorios. Se encontraron altos porcentajes de infección por T. cruzi y alimentación con sangre humana en especies de triatominos consideradas secundarias en el país. Se encontró que el posible origen de uno de los brotes de transmisión oral fue la contaminación de alimentos con heces de triatóminos, mientras que en el segundo brote el posible origen corresponde a la contaminación de alimentos con secreciones odoríferas de zarigüeyas. En las leishmaniasis, la PCR-HRM de HSP-70 permite la identificación de L. amazonensis en el subgénero L. Leishmania y de L. panamensis en el subgénero L. Viannia; mientras ITS-1 permite la discriminación entre L. amazonensis y L. infantum y entre L. braziliensis y L. guyanensis. Mediante secuenciación del gen citocromo b se logró la detección de dos especies de Leishmania spp. que no habían sido previamente reportadas en el país L. equatoriensis y L. lainsoni y se realizaron mapas de distribución de todas las especies detectadas, así como su distribución en todo el circuito epidemiológico.
Se logró la implementación exitosa de diferentes técnicas moleculares que fueron de utilidad para diagnóstico y epidemiología molecular de la enfermedad de Chagas y de las leishmaniasis, proporcionando nuevo conocimiento y dejando disponibles dichas técnicas para su uso en el país mediante el Instituto Nacional de Salud.
Descripción
Abstract
Chagas disease and leishmaniasis are diseases of great epidemiological importance in Colombia. Molecular techniques provide tools that facilitate the study of these diseases. For this reason, the objective of this study was the implementation of molecular techniques to improve diagnosis and molecular epidemiology studies in the country.
708 samples of patients with Chagas' disease, 245 triatomines and 39 reservoirs were collected. The following molecular techniques were applied: conventional and real-time PCR for diagnosis, quantification and genotyping of T. cruzi in samples from patients, triatomines and reservoirs. PCR-HRM for determination of food sources of triatomines. Microsatellite analysis in samples from patients, triatomines and reservoirs involved in outbreaks of oral transmission. The above, in order to determine the operative capacities of molecular techniques, parasitic loads and DTUs in patients with Chagas' disease. Additionally, to know the triatomic infection rates, DTUs and food preferences of triatomines in the country and to perform analysis of molecular epidemiology in two outbreaks of oral transmission in Colombia. As for Leishmaniasis, isolates obtained from patients with cutaneous leishmaniasis, sandflies and reservoirs were included in the study. A PCR-HRM was designed to identify the six species of Leishmania spp previously described in the country. Amplification and sequencing of the cytochrome b gene for the identification of Leishmania spp.
In Chagas' disease, the diagnostic performance of the molecular tests was better in the acute phase than in the chronic phase of the disease. Statistically significant differences were observed between parasite loads according to the clinical phase. The wide distribution of DTU TcI in patients, triatomines and reservoirs is reaffirmed. High percentages of T. cruzi infection and human blood feeding were found in triatomine species considered secondary in the country. It was found that the possible origin of one of the outbreaks of oral transmission was food contamination with feces of triatomines, whereas in the second outbreak the possible origin corresponds to the contamination of foods with odoriferous secretions of opossums. In the leishmaniasis, HSP-70 PCR-HRM allows the identification of L. amazonensis in the subgenus L. Leishmania and of L. panamensis in the subgenus L. Viannia; While ITS-1 allows discrimination between L. amazonensis and L. infantum and between L. braziliensis and L. guyanensis. By means of sequencing of the cytochrome b gene the detection of two species of Leishmania spp. Which had not previously been reported in the country L. equatoriensis and L. lainsoni, and distribution maps of all the species detected, as well as their distribution throughout the epidemiological circuit.
Successful implementation of different molecular techniques that were useful for diagnosis and molecular epidemiology of Chagas' disease and leishmaniasis was achieved, providing new knowledge and making available these techniques for use in the country through the National Institute of Health.