Protocolo para infección de células EA.hy926 por distintas cepas de citomegalovirus humano y determinación del establecimiento de latencia
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2020
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Resumen
Antecedentes: La infección in vivo de células endoteliales por citomegalovirus tiene un papel fundamental en el desarrollo de patologías asociadas con este virus; permite la replicación viral, el establecimiento de latencia y facilita el paso del virus desde la sangre a los tejidos. Los estudios que evalúan la latencia se realizan en cultivos primarios y no en líneas celulares como EA.hy926 y normalmente se emplean cepas de laboratorio. Objetivo: Estandarizar un protocolo de cultivo e infección de células Eahy926 con cepas de HCMV y determinar el establecimiento de latencia. Metodología: Las células EA.hy926 se cultivaron en DMEM + SFB al 10% + antibiótico - antimicótico al 2%, se incubaron en una atmósfera de CO2 al 5% y 37ºC. Estas células se tomaron en pasaje doce. Cuando alcanzaron una confluencia del 90%, se sembraron en placas de 12 pozos, 60,000 por pozo. Después de 24 horas, se infectaron con Towne y un aislado clínico con un MOI de 0.1 y 0.5. Se centrifugaron a 337g durante 30 minutos a 25 ° C, se incubaron durante 2 horas a 37 ° C. Se retiró el inóculo y se adicionó medio fresco. Las células fueron evaluadas a las 24, 48, 72 y 96 horas postinfección. Resultados: El establecimiento de infección de Towne se detectó por PCR a un MOI de 0.1 a las 48 y 96 horas posinfección. Se observó efecto citopático a un MOI de 0,5 a las 48, 72 y 96 horas posinfección. No se observó efecto citopático en las células infectadas con el aislado clínico en los tiempos evaluados. La latencia se puede determinar mediante RT-PCR para los genes UL138, UL111A, UL81-UL82, US28 o por inmunofluorescencia indirecta para la proteína UL138 o para IE1 /2 que no se debe detectar si se establece latencia. Conclusiones: El modelo de infección en células EA.hy926 es una buena alternativa para el estudio de infección latente en células endoteliales y es una opción segura y económica. La infección lítica por Towne se puede detectar en las células EAhy926, con los MOI y tiempos evaluados. El mismo resultado no se observó con el aislado clínico.
Descripción
Abstract
Background: In-vivo infection of endothelial cells by cytomegalovirus has a fundamental role in the development of pathologies associated with this virus. It allows viral replication, the establishment of latency and facilitates the passage of the virus from the blood to the tissues. Studies evaluating latency are performed in primary cultures and not in cell lines such as EA.hy926, and laboratory strains are normally used. Objective: To standardize a culture and a protocol for EA.hy926 cells infection with HCMV strains and determine the establishment of latency. Methods: EA.hy926 cells were grown in DMEM + 10% SFB + 2% antibiotic-antimycotic solution. Cells were incubated at a 5% CO2 atmosphere and 37ºC. These cells were taken in passage twelve. After reaching 90% confluence, cells were plated in 12-well plates, 60,000 per well. 24 hours later, they were infected with Towne strain and clinically isolated with MOI of 0.1 and 0.5. They were centrifuged at 337g for 30 minutes at 25°C, and incubated for 2 hours at 37°C. The inoculum was removed and fresh medium was added. The cells were evaluated at 24, 48, 72 and 96 hours post infection. Results: The establishment of infection by Towne strain was detected by PCR at MOI of 0.1, 48 and 96 hours post infection. Cytopathic effect was observed at MOI of 0.5, 48, 72 and 96 hours post infection. No cytopathic effect was observed in cells infected with the clinical isolate at the evaluated times. Latency can be determined by RT-PCR for the following genes: UL138, UL111A, UL81-UL82, US28; or by indirect immunofluorescence for UL138 protein or for IE1/2, which should not be detected if latency is established. Conclusions: The EA.hy926 cell infection model is a good alternative for the study of latent infection in endothelial cells, and is a safe and economical option. Lytic infection with Towne strain can be detected in EA.hy926 cells with MOIs and times evaluated. The same result was not observed with the clinical isolate.
Palabras clave
Citomegalovirus, Células endoteliales, Latencia
Keywords
Cytomegalovirus, Endothelial cells, Latency